苗竹林, 宋革, 崔蓉, 鐘興明, 姜榮華, 劉宇, 鄧華倩

廣東省生殖醫(yī)院、廣東省生殖科學(xué)研究所、國家衛(wèi)生和計劃生育委員會男性生殖與遺傳重點實驗室(廣東廣州 510600)

流式細胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)是20世紀 70 年代快速發(fā)展起來的一門高新檢測技術(shù)，運用激光技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)及細胞免疫學(xué)等知識，通過對細胞表面特征及細胞內(nèi)因子進行分析，并在分子水平上對細胞進行快速定性和定量研究，同時對單細胞或其他生物粒子進行功能分析并分選的一種檢測手段[1]。激光流式細胞檢測技術(shù)在兒科、免疫科、血液科、腫瘤科等臨床多個學(xué)科應(yīng)用廣泛，是疾病診治及預(yù)后評估的重要輔助檢查手段[2]。但是，在婦產(chǎn)科尤其在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價值還不明確。生殖面臨的主要問題是不孕與流產(chǎn)，近年來不孕不育患者逐年增加，不孕癥患者尤其是不明原因的不孕癥及自然流產(chǎn)目前認為與免疫因素有關(guān)[3]，是否可以通過流式細胞檢測不孕癥患者淋巴細胞亞群變化？早期、快速評估患者免疫功能尚存在爭議，且臨床應(yīng)用價值不確定，需要進一步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年2月至2020年6月期間，廣東省生殖醫(yī)院因不孕或自然流產(chǎn)就診的女性患者，年齡20～44歲。經(jīng)患者同意行流式細胞檢驗。FACScalibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson，BD公司)，溶血素(FACS lysing solution)、CD45 PerCP、 CD56 FITC、CD3APC、CD19 FITC、CD16PE、CD5 APC、CD4 FITC，CD8PE鼠抗人熒光抗體購自美國BD公司。檢測項目包括：T淋巴細胞及其亞群：CD3+T、CD4-CD8+/CD3+、CD4+CD8-/CD3+、CD4+/CD8+T細胞；自然殺傷細胞(natural killer cell,NK細胞)及其亞群：CD3-CD56+、CD3+CD56+NKT、CD56dimCD16+、CD56brightCD16-NK細胞；B淋巴細胞及其亞群：CD19+B，CD5+CD19+B細胞。實驗過程嚴格按試劑說明書進行，首先在流式上樣管做好標記，每個管中加入對應(yīng)檢驗抗體20 μL，之后加入50 μL外周血，混勻，室溫(20～25℃)避光孵育15 min。加入450 μL 1X FACS lysing solution 輕輕混勻，室溫(20～25℃)避光孵育15 min，加入2 mL PBS，混勻，1 200 r/min離心5 min，去上清液。300 μL PBS 重懸，統(tǒng)一在流式細胞儀上機檢測。

1.2 判斷標準 依據(jù)本實驗室建立的正常參考值范圍結(jié)合文獻報道，淋巴細胞參考值范圍：NK細胞為8.1%～18.0%，T淋巴細胞61.1%～77.0%，B淋巴細胞7.3%～18.2%，高于或者低于正常參考值范圍均屬于異常。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以頻數(shù) (百分率) 表示。使用Cell Quest軟件計算CD3+T淋巴細胞，CD19+B淋巴細胞，CD3-CD56+NK細胞亞群比例。

2 結(jié)果

2.1 不孕癥患者流式細胞檢測淋巴細胞及細胞亞群檢測結(jié)果 首先結(jié)合物理參數(shù)和特異性的熒光標志進行分群，之后進行分類，進一步確定比例關(guān)系。通過對CD45+細胞進行設(shè)門，得到穩(wěn)定的總的淋巴細胞，進一步對亞群進行分析，CD3+T淋巴細胞及其CD4+CD8-T細胞和CD4-CD8+T細胞亞群及百分比流式散點圖，見圖1，CD19+B淋巴細胞及CD5+CD19+B細胞，CD5-CD19+B細胞亞群分析過程流式散點圖，見圖2。CD56+NK細胞及其CD3+CD56+NKT細胞，CD56dimCD16+細胞CD56brightCD16-NK細胞亞群流式散點圖，見圖3。

注：選擇SSC/CD45+淋巴細胞(lymphocyte)作為分析對象， CD3+/LYMT淋巴細胞進行設(shè)門,Q1：CD4-CD8+T細胞占CD3+T細胞比例 32.1%； Q3：CD4+CD8-T細胞占CD3+T細胞比例62.7%

注：選擇SSC/CD45+淋巴細胞作為分析對象，圈出CD19+/LYM為B淋巴細胞進一步分析,Q2:CD5+CD19+B細胞比例6.19%

注：選擇SSC/CD45+淋巴細胞作為分析對象，圈出CD3-CD56+/LYM為NK細胞進一步分析,Q1:CD3-CD56+NK細胞占淋巴細胞比例25.1%; Q2:CD3+CD56+NKT比例3.55%，CD56dimCD16+比例87.4%，CD56brightCD16-NK細胞比例1.02%

2.2 不孕癥患者淋巴細胞檢測結(jié)果分析 不孕癥患者共檢測分析外周血T淋巴細胞及其亞群1 959例，其中1 380例在正常范圍，占總檢測例數(shù)的70.44%，異常例數(shù)579例，占總檢測例數(shù)的29.56%；其中增高人數(shù)占59.41%(344/579)，降低占40.59%(235/579)。檢測分析外周血B淋巴細胞及其亞群3 118例；其中2 542例在正常范圍，占總檢測例數(shù)的81.53%，異常例數(shù)576例，占總檢測例數(shù)的18.47%，異常例數(shù)中增高人數(shù)占63.72%(367/576)，降低占36.28%(209/576)。NK細胞及其亞群2260例，其中1153例在正常范圍，占總檢測例數(shù)的51.02%，異常例數(shù)1 107例，占總檢測例數(shù)的48.98%；其中增高人數(shù)占77.33%(856/1 107)，降低占22.67%(251/110 7)，見表1。

表1 不孕癥患者淋巴細胞檢測及結(jié)果分析 例(%)

3 討論

不孕癥是目前危害女性生殖健康的主要原因，據(jù)報道我國育齡婦女中不孕癥發(fā)病率約 10%～15%，且有逐年增加趨勢[4]。不孕癥包括不能妊娠和妊娠后自然流產(chǎn)兩個方面的問題。

不孕癥不是獨立的疾病，它是由多種疾病以及多種原因引起的生殖功能障礙。包括不容易受孕與妊娠后胚胎停止發(fā)育，正常妊娠是一個復(fù)雜的生理過程，女性必需具備正常的卵泡發(fā)育及排卵；正常的子宮內(nèi)環(huán)境及發(fā)育正常且通暢輸卵管；男方必需有發(fā)育正常而且能夠排出的精子；任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都將導(dǎo)致不孕癥的發(fā)生[5]。進一步剖析引起這些問題的原因，有利于針對性的進行治療。

在臨床實踐過程中，不同于其他學(xué)科，例如兒科、血液科及腫瘤科，患者表現(xiàn)有明確的臨床癥狀提示血液及免疫系統(tǒng)功能的異常，之后經(jīng)過進一步檢測明確診斷。而育齡期女性的特點是多數(shù)發(fā)熱、疼痛等臨床表現(xiàn)不明顯，有些甚至僅僅表現(xiàn)為不孕或者妊娠后胚胎停止發(fā)育等自然流產(chǎn)現(xiàn)象。因此，除了一些遺傳、內(nèi)分泌及解剖學(xué)因素等明確的病因之外，對一些不明原因的不孕及流產(chǎn)患者是否需要評估免疫功能，如何來評估等問題一直是一個難題。

隨著生殖免疫學(xué)的快速發(fā)展，免疫因素導(dǎo)致的不孕及自然流產(chǎn)受到人們的重視，人體健康狀況是否能夠耐受妊娠帶來的變化，需要進行檢測。

淋巴細胞的水平是機體細胞免疫和體液免疫功能的重要指標，作為臨床應(yīng)用指標，需要動態(tài)檢測，因此，選擇高效，快速，穩(wěn)定性及重復(fù)性好，精密度高的檢測儀器，更能敏感地反映患者免疫功能的變化[6]。

近年來，流式細胞檢測技術(shù)發(fā)展迅速，經(jīng)熒光染色的細胞受激光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光信號通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號，從而進行細胞表面抗原分析，細胞分類和亞群分析[7]。目前，流式細胞檢測技術(shù)日臻完善，在臨床上的應(yīng)用日益成熟，動態(tài)評估及快速檢測成為可能[8]。流式細胞檢測技術(shù)對于人體細胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷、治療以及預(yù)后的評估有重要指導(dǎo)價值[2,9]。而在婦產(chǎn)科臨床工作中目前臨床應(yīng)用并不廣泛，應(yīng)用價值也不確定，對這項技術(shù)的利用還十分有限。

本課題采用流式細胞技術(shù)，主要檢測的淋巴細胞包括T淋巴細胞、B 淋巴細胞及 NK 細胞，這3種細胞是人體內(nèi)重要的免疫活性細胞，具有多種生物學(xué)功能，對機體細胞免疫應(yīng)答起到重要的調(diào)節(jié)作用[10]。檢測過程表明可操作性強，分群清晰，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

通過分析不孕癥患者外周血淋巴細胞占比變化，結(jié)果表明T、B和NK三種淋巴細胞都有不同程度的異常，表現(xiàn)為超過或低于正常參考范圍，提示不孕癥患者存在一定比例的免疫功能紊亂，值得引起患者及醫(yī)務(wù)工作者的重視。免疫力下降可以引發(fā)多種婦科疾病，同時一些內(nèi)外科及婦科疾病也引起免疫力的異常，是導(dǎo)致年輕女性生殖功能下降的主要原因之一，需要結(jié)合原發(fā)病變進行分析。

流式細胞檢測技術(shù)可以通過進一步分析各個淋巴細胞及其亞群變化來精細分析并評估患者的免疫功能，例如CD3+T細胞可進一步檢測CD4+細胞及 CD8+T細胞亞群數(shù)量及比值的變化[11]；CD19+B淋巴細胞進一步分化為CD19+CD5+B和CD19+CD5-B細胞；NK細胞進一步分為CD3+CD56+NKT細胞，CD56dimCD16+NK細胞，CD56brightCD16-NK細胞[12]。

流式細胞術(shù)通過淋巴細胞及其亞群的變化檢測為機體免疫系統(tǒng)的變化評估提供了幫助。本結(jié)果提示，應(yīng)用流式細胞檢測技術(shù)可以快速得出外周血淋巴細胞及其亞群狀態(tài)，動態(tài)研究淋巴細胞的變化趨勢，有利于揭示疾病發(fā)生的本質(zhì)，進一步指導(dǎo)臨床實踐，為不孕癥等婦科疾病的高效、精準化防治提供理論依據(jù)[13]。

本研究正常值范圍參照本醫(yī)院以及文獻報道的成人參考值范圍[14]，目前國內(nèi)外育齡期女性外周血淋巴細胞亞群參考值范圍尚未見報道，值得進一步研究。