張薇，吳旸，董麗平，唐金海

近年來，乳腺癌已超過肺癌成為全球女性發(fā)病率最高，病死率第二的癌癥[1]。三陰性乳腺癌是一種特殊亞型的高侵襲性乳腺癌，具有常規(guī)治療療效差、患者預后差、復發(fā)耐藥率高、總體生存率低的特點。目前，手術、化療、放療、內分泌治療、分子靶向治療及免疫治療仍是乳腺癌最常用的治療方案[2-4]。其中，新輔助化療已經成為三陰性乳腺癌標準治療方案之一。臨床常用的乳腺癌化療藥包括小分子類和蛋白類，其作用機制是通過干預核酸和蛋白質的生物合成和功能，從而抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡。其中，乳腺癌治療常用的小分子類藥物如他莫昔芬、依西美坦、紫杉醇等可以特異性地阻斷腫瘤生長、增殖過程中所必需的信號轉導通路[5-6]。蛋白質類藥物主要是指抗體藥，如曲妥珠單抗、拉帕替尼等，它們通過與靶細胞抗原結合進入腫瘤細胞，經裂解后釋放細胞毒藥物殺傷細胞。然而，由于廣泛聯(lián)合用藥和乳腺癌細胞周期的失調，不良反應及乳腺癌耐藥率不斷上升[7]。三陰性乳腺癌的激素受體和人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)基因為陰性，常規(guī)的內分泌和靶向治療更是無從應用，因此亟需發(fā)現新的安全有效的治療藥物。

與小分子藥物相比，多肽類藥物對目標腫瘤具有更高的親和力和特異性，不良反應較低，可以增加腫瘤對其他治療方法的敏感度。與抗體藥物相比，多肽類藥物體積小，更易滲透到組織，更容易改造[8]。多肽類藥物主要通過誘導腫瘤細胞凋亡和壞死，抑制腫瘤血管生成，激活抗腫瘤免疫應答等機制發(fā)揮作用[9]。2018年，美國食品藥物管理局(FDA)批準了第1個專門用于治療胃腸胰腺神經內分泌腫瘤患者的藥物177Lu-dotatate，它是一種生長抑素類似物和放射性核素的螯合物，通過多肽受體介導的放射性核素靶向治療(PRRT)治療腫瘤患者。Melflufen(Melphalan Flufenamide，又名Pepaxto)則是FDA批準的首個抗癌肽偶聯(lián)藥物，被用于治療復發(fā)性/難治性多發(fā)性骨髓瘤成年患者。FK506結合蛋白樣蛋白(FK506-binding protein like，FKBPL)，作為免疫親和蛋白家族的成員，是一種有效的分泌型抗血管生成蛋白[10]。FKBPL的高度有效的抗血管生成作用是由于N-末端區(qū)域內的一個獨特序列，即FKBPL氨基酸34-58的24肽，通過CD44依賴機制抑制血管生成[11]。同時，FKBPL也是乳腺癌的預后生物標志物，能夠有效預測乳腺癌內分泌治療的敏感度[12-13]。因此，FKBPL有潛力通過抗血管生成來治療三陰性乳腺癌。

盡管多肽藥物在抗腫瘤過程中療效顯著，但其易被蛋白酶水解、理化穩(wěn)定性較差、體內半衰期短、口服生物利用度低等缺點導致多肽類藥物不能穩(wěn)定地發(fā)揮作用。因此，需要借助藥物載體將多肽藥物遞送到三陰性乳腺癌細胞，穩(wěn)、準、狠地殺傷腫瘤細胞。外泌體是細胞分泌的直徑在100～1 000 nm之間的細胞外囊泡，包裹豐富的內容物如RNA、蛋白和脂質等[14-16]。外泌體不僅可以作為腫瘤診斷的標志物，還可以作為腫瘤治療藥物的重要載體[17-22]。對外泌體進行基因修飾形成多價抗體重定向外泌體，可識別CD36和HER2，從而激活細胞毒T細胞，特異性攻擊HER2陽性乳腺癌細胞[23]。多項研究表明外泌體裝載多肽在多種疾病的動物模型中都有較好的治療效果，在獲得良好的療效的同時均未發(fā)現明顯的不良反應[24-26]。與外源性生物材料相比，外泌體可以避免免疫識別、炎癥毒性、快速清除等難題[27-31]。本研究制備了一種細胞自然分泌的攜帶抗腫瘤多肽藥物的外泌體，命名為“外泌體肽”，評估其在三陰性乳腺癌治療中的應用效果。結果顯示，“外泌體肽”表現出了較好的抗血管生成能力從而可以有效殺傷三陰性乳腺癌細胞，有望實現高效三陰性乳腺癌療效。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑及材料 人腎上皮細胞293T細胞購自中國上海中科院細胞庫，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。人臍靜脈內皮細胞HUVEC細胞和人三陰性乳腺癌細胞HCC1937細胞購自中國上海中科院細胞庫，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸緩沖液(PBS)、多聚甲醛均購自于江蘇凱基生物技術有限公司。胎牛血清(FBS)購自于美國Gibco公司。

1.2 表達FKBPL多肽的載體構建 將質粒載體PCDNA3.1與合成的目的基因分別加入含16 μl(1 μg)載體質粒/目的基因、2 μl 10×Buffer Cut S、1 μl(15 U)EcoRI和1 μl(15 U)NotI的酶切反應體系，37 ℃反應1 h后，切膠回收載體和目的基因片段。酶切后載體DNA片段經切膠純化后，與上述目的基因段建立如下含有1 μl10× T4 DNA連接酶Buffer、3 μl酶切后的載體片段、5.5 μl酶切后的目的基因片段及0.5 μl T4 DNA連接酶的T4連接酶反應液體系，在37 ℃下反應1 h。隨后，將甘油凍存保存的Stbl3菌接種劃平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆至裝有3 ml LB的試管中，37 ℃ 220 rpm振搖12 h，吸取1 ml菌液至1.5 ml離心管中，4 ℃條件下12 000 g離心3 min，棄上清，用400 μl預冷的CaCl2重懸菌體沉淀，12 000 g離心3 min，棄上清，用200 μl預冷的CaCl2再次重懸菌體沉淀，置冰上過夜。將上述重組完的20 μl反應液全部加入200 μl感受態(tài)細菌中，置冰上1 h，42 ℃熱激90 s，迅速置冰中5 min，加入600 μl經過37 ℃預熱的LB培養(yǎng)液，37 ℃條件下以220 rpm速度振搖1 h，離心后全部涂布于含100 μg/ml Amp的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。隨機挑取4個單克隆至含,100 μg/ml Amp的3 ml LB培養(yǎng)液的試管中，37 ℃條件下以220 rpm振搖4 h，取100 μl離心，取菌體沉淀，用50 μl ddH2O重懸，沸水浴5 min，離心取1 μl上清液做模板，進行PCR鑒定，反應結束后，取10 μl進行1.0% Agarose電泳鑒定，將經菌落PCR鑒定為陽性克隆進行測序驗證。最終得到3個表達FKBPL多肽的質粒載體，命名為FK1、FK2和FK3質粒。

1.3 FKBPL多肽的細胞表達和鑒定 用上述FK1、FK2和FK3 3種質粒轉染人胚腎細胞株293T。首先，將293T細胞接種至6孔板中，待細胞匯合度達到70%～80%時，根據Lipo3000轉染試劑(Thermo Fisher Science，美國)的試劑盒步驟進行質粒轉染，轉染體系包括充分混勻的125 μl Opti-MEM培養(yǎng)基和3.75 μl Lipo3000試劑(A管)；充分混勻的125 μl Opti-MEM培養(yǎng)基、2.5 μg 質粒DNA(含有目的蛋白的質粒/對應空載質粒)及5 μl P3000試劑(B管)。將B管內容物加入A管，輕柔混勻后室溫孵育10 min，滴加到含有1.75 ml無血清無抗培養(yǎng)基的六孔板中，待轉染6 h后換成2 ml完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。隨后，收集細胞，加入組織裂解液(RIPA，碧云天，中國)、蛋白酶抑制劑(PMSF，索萊寶，中國)裂解后，加入FKBPL多克隆抗體(Proteintech，中國)抗體。使用BIO-RAD曝光儀(ChemiDOCTm XRS+，BioRAD，USA)曝光，使用Image Lab采集圖像并進行相應調整分析。

1.4 外泌體肽的制備 使用轉染了FKBPL多肽基因的293T細胞進行FKBPL外泌體肽制備。所有細胞均置于37 ℃，5%CO2飽和濕度下。待細胞達到70%～80%的融合時，棄去舊培養(yǎng)基，加入適量PBS潤洗后棄去，重復兩次。使用含EDTA胰酶消化細胞，收集液體,4 ℃下500 g轉速離心10 min棄去上清。加入1 ml PBS重新懸浮細胞沉淀，取10 μl細胞懸液，使用臺盼藍染料進行染色，并通過細胞計數儀計數。取2×107個細胞于新的15 ml無菌管中，加入適量PBS清洗細胞，4 ℃下以500 g速度離心10 min，重復2次，將細胞重懸至濃度含蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor cocktail，04693132001，Roche，瑞士)。

本研究準備了10 μm、5 μm和1 μm的聚碳酸酯膜過濾膜(Nuclepore；Whatman Inc.，美國)，通過不同孔徑的過濾膜將細胞連續(xù)擠出。首先，將10 μm膜置于微型擠出儀(Avanti Polar Lipides，英國)中，加入準備好的細胞懸液，使用擠出儀擠出5次。隨后，將收集液依次通過5 μm和1 μm的聚碳酸酯膜過濾膜，使用微型擠出儀分別擠出5次。以上收集到的液體中包含細胞衍生的外泌體和較大的細胞碎片，因此需要進一步純化獲得均勻尺寸的外泌體。使用超速離心機，通過密度梯度離心法對收集的外泌體進行純化。使用碘克沙醇(OptiPrepTM，Sigma-Aldrich，美國)作為密度梯度離心介質，分別配制10%和50%碘克沙醇溶液。將1 ml 50%碘克沙醇溶液，2 ml和7 ml 10%碘克沙醇收集樣本依次加入超速離心管中(收集樣本在最上層)，4 ℃ 100 000 g離心2 h?；厥?0%和50%碘克沙醇液面間富集的細胞外泌體，4 ℃下100 000 g離心2 h。棄去上清，加入100 μl PBS重懸，樣本置于-80 ℃冰箱儲存。

1.5 透射電鏡(TEM)鑒定外泌體形態(tài) 取適當濃度的樣品滴于電鏡銅網上，孵育2 min后，用蒸餾水清洗，再將樣品置于2%醋酸鈾(SPI，美國)負染2 min，待樣本干燥后，使用透射電子顯微鏡(Tecnai G2 Spirit Bio Twoic，Fei，美國)進行形態(tài)表征。

1.6 納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)鑒定外泌體尺寸

為了分析外泌體的粒徑分布和數量，使用ZetaView?PMX120納米顆粒跟蹤分析儀(ZetaView?PMX120，Particle Metrix，德國)。使用標準品校準后NTA后，用PBS將外泌體樣品稀釋至適當倍數后泵入測定。ZetaView的攝像機以60 s視頻的形式記錄單個粒子的散射，以確定平均速度和擴散率。最后，使用ZetaView?軟件用于儀器控制和數據分析。

1.7 Western blot分析外泌體蛋白標志物 選擇CD9和CD63作為表面標志物對外泌體進行鑒定。組織裂解液(RIPA，碧云天，中國)、蛋白酶抑制劑(PMSF，索萊寶，中國)以100∶1的比例配置外泌體裂解液。向離心收集的外泌體沉淀中加入10～20 μl裂解液，充分裂解外泌體后得到外泌體蛋白樣品。加入SDS-PAGE Loding Buffer(新賽美，中國)混勻，99 ℃變性10 min。在PAGE凝膠的每個泳道中加入同等質量的蛋白樣品，電泳分離，轉至0.22 μm PVDF膜上。加入Anti-CD9抗體(1∶1 000，ab223 052，Abcam，美國)、CD63(1∶1 000，ab68 418，Abcam，美國)于4 ℃孵育過夜后，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天，中國)在室溫下孵育1 h。使用BIO-RAD曝光儀(ChemiDOCTm XRS+，BioRAD，USA)曝光，使用Image Lab采集圖像并進行相應調整分析。

1.8 FKBPL多肽的細胞表達及鑒定 首先，合成24個氨基酸的人內源性FKBPL多肽(QIRQQPRDPPTETLELEVSPDPAS)，其序列中A位氨基酸為重標氨基酸，作為標準品用于FKBPL多肽的質譜鑒定。首先，取定量內標FKBPL多肽溶解于預先配制好的0.1%的甲酸水溶液中(甲酸，水；V∶V，1∶1 000)使其濃度為1 pM。用0.1%甲酸溶液稀釋配制中間稀釋溶液，終濃度為100 fM。加入適量預先配制好0.1%的甲酸水溶液于100 KD、10 KD的濾膜中，在4 ℃、3 000 rpm條件下離心5 min，棄套管中液體。吸取50 μg的小肽實際樣本或通過超聲破碎的含FKBPL外泌體于100 KD超濾膜中，添加380 μl 0.1%的甲酸水溶液，充分混勻后在4 ℃、13 000 rpm離心20 min，該步操作重復2次。取超濾膜套管中的液體于10 KD的超濾膜中，在4 ℃、13 000rpm離心20 min，待100 KDa超濾膜套管中的液體用完后，在10 KDa的超濾膜中加入適量的 0.1%的甲酸水溶液，充分混勻后，在4 ℃、13 000 rpm離心20 min，該步操作重復2次。將10 KD超濾膜套管中截留的液體轉移到EP管中，于真空濃縮儀中濃縮。后用0.1%甲酸溶液復溶為25 μl。步驟濃縮后干粉用0.1%甲酸溶液復溶為25 μl；取10 μl復溶樣品和10 μl內標中間稀釋液，內標終濃度為50 fM/μl，蛋白濃度為1 μg/μl。

隨后，以色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm 2.1×100 mm(Waters)；流動相A：0.1%甲酸水(甲酸，水；V∶V，1∶1 000)，流動相B：0.1%甲酸乙腈(甲酸，乙腈；V∶V，1∶1 000)。液相方法為0～1.0 min，10%B相；1.0～3.0 min，10%～90%B相；3.0～3.5 min，90%B相；3.5～3.8 min，90%～10%B相；3.8～5.0 min，90%～10%B相。采用正離子對數據采集，電噴霧電壓5 500 V，離子傳輸管溫度為400 ℃，Gas1、Gas2均為50 arb，碰撞能量均為30 eV為質譜條件，應用skyline計算方法對小肽及內標預測的b離子和y離子轉移到質譜儀(QTRAP 6500+，SCIEX，美國)，并采用多反應監(jiān)測(MRM)對數據進行采集與分析。

質譜法檢測并計算外泌體肽攜帶的FKBPL短肽含量的具體方法為，將定量的含FKBPL短肽的外泌體置于含1%體積比的Triton X-100(碧云天，中國)水溶液中并超聲破碎5 min，隨后加入總體積量0.1%的甲酸溶液并按上述方法檢測其質譜峰強度并計算其所含FKBPL短肽的量。

1.9 FKBPL對乳腺癌患者影響的生信分析 首先，從UCSC Xena(https：//tcga.xenahubs.net)下載癌癥基因組圖譜(the cancer genome alas，TCGA)泛癌標準化數據和臨床信息。隨后，從基因集富集分析(GSEA)數據庫(http：//software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)下載了50個標志性基因集?；蚪M變異分析(GSVA)譜轉換R的GSVA(V1.25.4)軟件包被用作估計關鍵基因集變異的非參數、無監(jiān)督方法[32]。GSVA 算法的輸入是log2微陣列表達值的基因表達矩陣和預先定義的基因集或預先存在的基因集(MSig)數據庫的集合。GSVA 分數使用類似Kolmogorov-Smirnoff(KS)的隨機游走統(tǒng)計和特定樣本和基因集的負值以非參數方式計算。最后，將標準化的FKBPL表達值與H通過轉換所得的HALLMARK_ANGIOGENESIS通路的GSVA分數進行相關性分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.10 細胞對FKBPL外泌體肽的攝取 為了評估HCC1937細胞對FKBPL外泌體肽的攝取情況，首先，將HCC1937細胞以每孔2×105個細胞接種在35 mm培養(yǎng)皿中，在5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。隨后，向含FKBPL外泌體肽溶液中加入染色液(PKH26，Sigma-aldrich，美國)，混勻后在4 ℃下，以100 000 g轉速超速離心1 h，清洗2次。重懸后，加入到HCC1937細胞中共孵育6 h，取出培養(yǎng)皿加入細胞固定液即4%多聚甲醛固定30 min。加入2 mg/ml甘氨酸(碧云天，中國)中和過量醛基，搖床孵育5 min，后加入1 ml滲透劑(碧云天，中國)孵育10 min，再加入體積比為1∶1 000的DAPI染色液(碧云天，中國)，用PBS清洗后置于激光共聚焦顯微鏡(LSM5 Live Carl Zeiss，德國)下拍攝。

1.11 外泌體肽影響三陰乳腺癌增殖分化實驗 通過流式細胞法檢測HEMA包被的培養(yǎng)板上HCC1937細胞中Delta樣配體4(DLL4)和CD44的表達。具體地，用1.2%的聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯(poly-HEMA，默克，中國)包被低黏附培養(yǎng)皿(NUNC，Thermo Scientific，美國)，經PBS清洗2次后，每皿加入1 000個HCC1937細胞在37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)24 h。隨后，分別向培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基中加入FKBPL短肽含量為0、100和500 nM的外泌體肽并繼續(xù)培養(yǎng)5 d。實驗結束后，用1.5%的胰蛋白酶消化細胞并重懸于1 ml PBS中，加入DLL4(MA5-17068，Invitrogen，美國)和CD44流式抗體(11～0441～82，Invitrogen，美國)孵育15 min。最后，通過流式細胞儀(BD FACS，美國)檢測DLL4和CD44的表達情況并統(tǒng)計。

1.12 HUVEC成管實驗 為了探討外泌體肽與腫瘤細胞血管生成關系，研究了外泌體肽對HUVEC細胞成管能力的影響。首先，在96孔板中每孔加入50 μl基質膠(Corning，美國)，置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min使其形成凝膠。在每孔中加入100 μl HUVEC細胞懸液(約含10 000個細胞)后，向培養(yǎng)基中加入相當于FKBPL短肽含量分別0 nM、100 nM和500 nM的外泌體肽。在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后至倒置顯微鏡(Primovert，Carl Zeiss，德國)下拍攝細胞形態(tài)。

2 結果與討論

2.1 外泌體肽的制備及表征 由于免疫細胞衍生的外泌體含有免疫細胞依賴性腫瘤排斥反應的功能性MHC/肽復合物，工程化外泌體主要通過免疫細胞分泌獲得。常見的獲得外泌體的免疫細胞包括：NK細胞[28]、T細胞[33-35]、巨噬細胞[36]以及DC細胞[37-39]。工程化外泌體可來源于轉染后的細胞分泌，但分離外泌體時大量多次離心會破壞外泌體結構，降低樣品質量，且重復純化必然導致外泌體損耗[40]。另一種方法是通過對細胞機械擠壓法獲得外泌體，僅1次純化可以快速獲得大量外泌體[41]。在此背景下，本研究選擇了擠壓法制備外泌體肽，流程如圖1所示。首先，對工具細胞進行FKBPL轉染，48 h后收集細胞，通過擠壓法制備外泌體肽。

圖1 外泌體肽制備流程示意圖

如圖2A所示，將目的基因序列片段通過酶切反應，克隆進入PCDNA3.1質粒載體中，成功制備了FKBPL基因目的短肽表達載體。圖2B中測序結果表明FKBPL基因全長、85個氨基酸基因片段和150個氨基酸的3種基因片段，通過Kpn1/BamH1酶切位點正確克隆進入PCDNA3.1質粒表達載體中。圖2C瓊脂糖凝膠電泳實驗表明，通過Kpn1/BamH1雙酶切實驗成功得到設計大小的目的基因片段，FKBPL基因目的短肽表達載體構建成功。質粒表達載體的成功構建，是FKBPL基因目的短肽表達的前提，實驗參考多篇成功表達FKBPL基因目的短肽的文獻，選取FKBPL基因全長、85個氨基酸基因片段和150個氨基酸基因片段構建了FK1、FK2和FK3質粒載體，以期后續(xù)成功得到目的短肽。隨后，通過Western blot檢測了這3種質粒轉染后的293T細胞中FKBPL基因的表達水平，結果顯示FKBPL基因全長(FK1)成功表達，FK2和FK3為短肽鏈，則無法通過Western blot法檢出，因此條帶與對照組無顯著性差異(圖2D)圖2Ea為未裝載多肽的外泌體。圖2Eb所示TEM照片中清晰顯示出外泌體的囊泡狀結構，其形態(tài)與圖2Ea一致。未表達FKBPL的外泌體肽的平均尺寸為(109.68±2.37)nm(圖2Fa)，NTA捕獲的FKBPL外泌體肽的平均粒子尺寸為(141.16±4.44)nm(圖2Fb)，符合預期的外泌體特征。圖2G中Western blot檢測表明，CD9和CD63在外泌體提取物中表達豐度高，而在細胞中沒有檢測到表達。這些數據表明，本研究成功獲取了具有完整外泌體結構的外泌體肽。

2.2 外泌體肽中的FKBPL短肽鑒定 通過液質聯(lián)用質譜的方法鑒定了由質粒轉染的293T細胞所制備的外泌體肽中的目的短肽FKBPL。根據陽性合成的重標短肽FKBPL的質譜結果，實驗分析出5個不同分子質量的b離子和y離子作為FKBPL短肽的鑒定內標物來檢測外泌體中的目的FKBPL短肽，該實驗方法為多肽定性定量的通用檢測方法，且具有優(yōu)異的準確性。結果如圖3A所示，與陽性重標的化學合成短肽FKBPL一致，FK1、FK2和FK3 3種質粒轉染的293T細胞制備的FKBPL外泌體肽樣本在質譜保留時間3.0 s處出現特征峰。在同樣取10 000個由FK1、FK2和FK3質粒轉染制備的外泌體肽樣本中，FK2的質譜峰強度最大。說明FK2質粒轉染293T細胞后，外泌體負載的目的FKBPL短肽含量最高。隨后，通過質譜加內標方法檢測了所制備的外泌體肽中FKBPL短肽含量。如圖3B所示，遞增濃度(1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000個外泌體)的外泌體肽溶液中FKBPL短肽的含量數據顯示，隨著外泌體量的增加，FKBPL短肽含量由55.27 nM增加至655.69 nM并達到了一個平臺值。

2.3 外泌體肽的抗癌效應 圖3C對32種TCGA癌癥類型的血管生成相關通路進行Pearson相關性分析結果顯示，FKBPL與胸腺瘤(r-0.505)、間皮瘤(r-0.396)、乳腺癌(r-0.353)的血管生成呈負相關(r-0.353，P<0.01)。為了驗證FKBPL外泌體肽對三陰性乳腺癌的療效，首先用PKH26染色液、DAPI染色液分別將FKBPL外泌體肽和細胞核染成了紅色和藍色，通過激光共聚焦顯微鏡拍攝的照片(圖3D)可觀察到外泌體肽被三陰性乳腺癌細胞HCC1937細胞大量攝取，有望提高FKBPL多肽的生物利用度。隨后，為了評估外泌體肽對HCC1937細胞功能的影響，本研究通過流式細胞術檢測poly-HEMA包被的培養(yǎng)皿上HCC1937細胞DLL4和CD44表達情況。實驗結果如圖3E所示，向HCC1937細胞加入等同于100 nM和500 nM FKBPL短肽的外泌體肽后，HCC1937細胞的DLL4表達顯著降低至57.4%和25.4%，說明外泌體肽干擾了腫瘤細胞的干性維持。同時，腫瘤干性標志物CD44表達也顯著性降低至至32.7%和28.4%。腫瘤細胞的增殖分化與腫瘤血管生成密切相關，大量新生血管的出現往往是腫瘤惡性增殖的前提。腫瘤新生血管的生成過程中往往伴隨著DLL4和CD44表達的增加。CD44與其主要配體透明質酸(HA)結合后，會觸發(fā)特異性信號通路促進腫瘤血管生成[42-44]。有研究發(fā)現，CD44+/CD24-乳腺癌細胞促進血管生成的能力更強。古老的抗蠕蟲藥物可減少三陰性乳腺癌中CD44+/CD24-細胞群數量，抑制腫瘤生長、血管生成以及肺和肝轉移，降低循環(huán)血液中MMP-2和MMP-9水平[45]。DLL4是Notch信號通路的重要組成部分，介導干細胞的自我更新和血管發(fā)育，抗DLL4藥物可通過干擾DLL4/Notch通路靶向腫瘤干細胞和腫瘤血管來改善腫瘤治療效果。在三陰性乳腺癌中，抗DLL4藥物和與紫杉醇(Taxol)聯(lián)合治療是有效的。基因表達分析顯示，抗DLL4影響間質血管相關基因及腫瘤和間質中Notch靶基因。在紫杉醇治療終止后，抗DLL4的納入可延遲乳腺癌復發(fā)。Zang等[46]采用RT-PCR對62例乳腺組織和22例癌旁正常組織進行研究，結果顯示，DLL4在乳腺癌組織中的表達量高于癌旁組織。他們指出DLL4表達水平與患者的淋巴結轉移、組織學分級、腫瘤直徑及臨床分期有關，并預測DLL4可能誘導腫瘤血管生成，促進乳腺癌的侵襲和轉移。腫瘤細胞FKBPL蛋白的表達量與其血管生成呈負相關關系，本研究數據提示，FKBPL外泌體肽可能通過HCC1937細胞的DLL4和CD44表達水平，抑制三陰乳腺癌的血管生成從而發(fā)揮抗癌效應。為了考察FKBPL短肽的外泌體肽對細胞血管生成的影響，進行了HUVEC細胞成管實驗。血管內皮細胞的快速生長是血管生成的一個必要條件，HUVEC細胞在培養(yǎng)板中往往形成環(huán)狀類血管結構。在基質膠上培養(yǎng)24 h后，HUVEC細胞形成了類圓形結構，表明其具有很好的血管生成能力(圖3F-a)。加入100 nM外泌體肽處理后，HUVEC細胞成散列線狀，無環(huán)形結構出現(圖3F-b)。而加入500 nM外泌體肽后，HUVEC細胞成塊狀聚集，細胞生長受到嚴重影響(圖3F-c)。據文獻報道，FKBPL基因通過影響通路上Notch4基因而影響腫瘤的血管生成。研究數據驗證了FKBPL外泌體肽具有同樣的抗血管生成活性，因此具有通過抑制血管生成進而抗癌的潛力。

2A:FKBPL質粒結構圖譜；2B:FKBPL質粒測序峰圖；2C:FKBPL質粒酶切圖；2D:FKBPL的Western blot分析；2E:外泌體(a)及外泌體肽(b)的代表性TEM照片，標尺為500 nm；2F:外泌體(a)及外泌體肽(b)的粒徑分布；2G:外泌體標志蛋白CD9和CD63的Western blot驗證圖2 外泌體肽的制備及表征

3A:液相高分辨高精密度質譜(LC-HRMS)分析譜圖；3B:外泌體肽的FKBPL多肽含量，a-f分別為1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000個外泌體的實驗組;3C:癌癥患者血管生成與FKBPL的相關性;3D:HCC1937細胞攝取外泌體肽的代表性共聚焦照片；3E:流式細胞術檢測poly-HEMA包被的培養(yǎng)皿上HCC1937細胞DLL4和CD44表達情況；3F:內皮細胞成環(huán)實驗的代表性照片(a為對照組，b和c分別為含100 nM和500 nM FKBPL短肽的外泌體肽處理組)圖3 FKBPL外泌體肽的表達鑒定及抗癌效應

3 結論

當前，臨床中治療三陰性乳腺癌是不用抗血管治療方案的。在三陰性乳腺癌的新輔助化療方案中，聯(lián)合貝伐單抗可顯著提高患者的完全緩解率。但是，貝伐單抗雖延長了晚期患者的無病生存期，并未使總生存率發(fā)生明顯改善。其他小分子酪氨酸激酶抑制劑如索拉非尼、阿帕替尼也未獲得有利結果，多靶點抑制劑靶點較多，容易產生“脫靶效應”，且并發(fā)癥明顯，以血液學毒性、手足綜合征、蛋白尿和高血壓最常見[47]。根據2019年ASCO會議報道的中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院宋爾衛(wèi)、劉強教授團隊開展的一項Ⅱ期臨床研究，阿帕替尼聯(lián)合PD-1抑制劑卡瑞利珠單抗的無化療方案在晚期TNBC患者中的應用可取得驚人療效，表明抗血管治療結合免疫治療可給三陰性乳腺癌患者帶來無需化療的創(chuàng)新治療方案。

Adam等[48]系統(tǒng)性地研究了抗血管肽AXT201對三陰性乳腺癌的治療效果，發(fā)現AXT201可調控三陰性乳腺癌血管正常化，并具有免疫激活功能。在此背景下，本研究以抗血管生成類多肽FKBPL為抗癌藥物，以外泌體為載體，構建了一種細胞自然分泌的攜帶抗腫瘤多肽藥物的外泌體載藥系統(tǒng)，提高了藥物生物利用度和靶向性，從而實現了對三陰性乳腺癌的治療，具有較好的應用前景，有望促進多肽類藥物的發(fā)展和臨床應用轉化。本研究篩選了目的多肽的種類、長度等參數，最終選擇了適合細胞自分泌的氨基酸長度的FKBPL多肽克隆至慢病毒載體中，最終使細胞穩(wěn)定產生目標藥物多肽而不被細胞內酶降解。實驗制備的FKBPL外泌體肽表現出較好的進入細胞能力，最終表現出良好的抗血管生成和抗癌效應。當前，可裝載的藥物種類少、不可裝載大分子靶向藥物、潛在的免疫原性和促進轉移的風險限制了外泌體作為藥物載體的發(fā)展。本研究提出了一種新型載藥方案，為外泌體載藥方案提供了新的思路，為外泌體的抗癌治療提供了方向。