崔一堯，趙承承，張工，黃匯，李晨，趙暉，巫玉云，趙潔

2020年女性乳腺癌首次超過肺癌成為全球女性最常見的惡性腫瘤，也是女性死亡的首要原因[1]。其中，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)的發(fā)病率約占乳腺癌整體發(fā)病率的15%[2-3]。由于TNBC具有增生相對(duì)活躍及轉(zhuǎn)移率高的特點(diǎn)[4]，早期即可能發(fā)生腹腔臟器轉(zhuǎn)移或腦轉(zhuǎn)移，部分患者初診即為晚期[5]。盡管在診治方面取得了一些進(jìn)展，但由于其高增殖能力和治療靶點(diǎn)的相對(duì)缺少，治療選擇比較有限，5年生存率僅為77%[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)在多種疾病病理生理過程中發(fā)揮重要功能，比如癌癥、帕金森病、糖尿病等[7-9]。lncRNAs可作為多種惡性腫瘤的競爭性內(nèi)源性RNA 來參與其發(fā)生發(fā)展與耐藥。例如，Sharma 等[10]發(fā)現(xiàn)lncRNA通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的內(nèi)源性活動(dòng)。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)GATA3-as1通過穩(wěn)定PD-L1蛋白和降解GATA3蛋白促進(jìn)TNBC進(jìn)展和免疫逃逸。我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫的分析，發(fā)現(xiàn)lnc-FAM83D-3基因的表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者的生存時(shí)間有影響。然而，lnc-FAM83D-3在乳腺癌中的表達(dá)模式和功能尚不清楚。因此，對(duì)lnc-FAM83D-3的研究有助于探索TNBC的發(fā)病機(jī)制以及評(píng)估患者的預(yù)后。本研究通過觀察lnc-FAM83D-3對(duì)TNBC細(xì)胞株HCC1937、MDA-MB-231增殖、侵襲、遷移和凋亡活動(dòng)的影響，探討lnc-FAM83D-3影響乳腺癌發(fā)展的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 TNBC細(xì)胞株HCC1937、MDA-MB-231、MCF-10A均購于中科院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基血清、雙抗購于美國Gibco公司。Trizol由上海普飛提供。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于TAKARA公司。引物、慢病毒由吉?jiǎng)P基因合成。質(zhì)粒提取試劑盒購于美國OMEGA公司。MTT試劑盒購于美國MCE公司。凋亡試劑盒購于中國福麥斯公司。雙熒光素酶活性檢測，試劑盒購于美國Promega公司。Transwell小室購于美國Corning公司。Matrigel購于美國BD公司。FAM83D抗體、GAPDH抗體購英國Abcam公司。

1.2 乳腺癌組織來源 收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院2017年1月至2020年5月保存的三陰性乳腺癌石蠟組織6例，及對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(距離癌組織邊緣>5 cm)?；颊咝g(shù)后病理組織學(xué)確診為TNBC，排除術(shù)前放療、化療或內(nèi)分泌治療者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情且簽署同意書。

1.3 數(shù)據(jù)資料收集 通過cBioPortal網(wǎng)站(http://www.cbioportal.org)從TCGA數(shù)據(jù)集下載并預(yù)處理乳腺癌數(shù)據(jù)集，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)法對(duì)目的基因在不同臨床資料的表達(dá)水平差異進(jìn)行分析。采用Kaplan-Meier方法檢驗(yàn)lnc-FAM83D-3基因的表達(dá)與乳腺癌患者生存期的關(guān)系。

1.4 慢病毒感染細(xì)胞 將細(xì)胞置于含有10%胎牛血清和1%雙抗的1640或DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的環(huán)境中貼壁培養(yǎng)。使用攜帶目的基因RNA干擾序列的慢病毒感染HCC1937、MDA-MB-231 細(xì)胞作為shlncRNA實(shí)驗(yàn)組，攜帶空載片段的慢病毒載體為shNC對(duì)照組。在細(xì)胞感染慢病毒72 h后按 2 μg/mL 的濃度添加嘌呤霉素，按時(shí)更換培養(yǎng)基，2周后于顯微鏡下挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)、傳代。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)TRIzol試劑提取總RNA后，首先使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用Nano-Drop2000c測定RNA濃度和質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诹_氏儀器上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用于靶標(biāo)擴(kuò)增。qPCR反應(yīng)體系為12 μl，其中1 μlcDNA，上下游引物各0.5 μl，SYBR 6 μl，加無酶水至12 μl，反應(yīng)條件為95 ℃、30 s，變性：95 ℃、5 s，退火：60 ℃、30 s，延伸：60 ℃、30 s。引物序列，lnc-FAM83D-3正向引物：5′-GCCATCGCAGACTTAGCT-3′，反向引物：5′-CACCACAACCTCCACCTC-3′；GAPDH作內(nèi)參，正向引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，反向引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)將細(xì)胞消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)；鋪板后再觀察各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞密度，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；從鋪板后第2天開始，培養(yǎng)終止前4 h加入20 μl 5 mg/ml的MTT于孔中；4 h后完全吸去培養(yǎng)液，加100 μl DMSO溶解甲瓚顆粒；振蕩器振蕩2～5 min，酶標(biāo)儀490/570 nm檢測OD值。

1.7 侵襲實(shí)驗(yàn) 在含有基質(zhì)膠的24孔板中加入細(xì)胞懸液200 μL，經(jīng)過48 h后進(jìn)行4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡觀察計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞。

1.8 細(xì)胞計(jì)數(shù) 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；根據(jù)細(xì)胞生長快慢決定鋪板細(xì)胞密度，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；從鋪板后第2天開始，每天Celigo檢測讀板1次，連續(xù)檢測讀板5 d；計(jì)算出每次掃描孔板中帶綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)量；繪制5 d的細(xì)胞增殖曲線。

1.9 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞鋪板后37 ℃過夜培養(yǎng)，使用劃痕儀對(duì)準(zhǔn)96孔板的上端中央部位，向上輕推形成劃痕；漂洗后37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)愈合程度使用Celigo掃板，分析遷移面積。

1.10 熒光原位雜交(FISH)根據(jù)待雜交目的基因信息序列設(shè)計(jì)合成特異性的寡核苷酸探針并做相應(yīng)熒光素標(biāo)記，具體如下：Lnc-FAM83D-3：5′-CY3-CAGUGGCGCAAUCUUGGCUCACCACAACCUC-3′；U6：5′-CY3-CACGAAUUUGCGUGUCAUCCUU-3′。目的細(xì)胞經(jīng)固定和透化后與探針雜交液37 ℃過夜孵育。DAPI復(fù)染核后，于正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.11 流式細(xì)胞術(shù) 按細(xì)胞凋亡試劑盒說明書，收集處理后的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞，與AnnexinⅤ和碘化丙啶 (PI)避光孵育15 min，經(jīng)BD流式細(xì)胞儀鑒定并計(jì)數(shù)不同分裂周期中的細(xì)胞。

1.12 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 按照3×104個(gè)/孔的密度將 293T 細(xì)胞接種于 96 孔板，24 h 后按試劑說明書轉(zhuǎn)染 miR-504-3p mimics 或 NC 和含 lnc-FAM83D-3 野生序列或突變序列的質(zhì)粒，48 h 后通過熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.13 Western bolt 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，10 min后，取50 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用封閉液(5%脫脂奶粉)封閉2 h，TBST洗滌3次，加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后加入二抗，搖床孵育2 h，清洗后進(jìn)行蛋白曝光，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度值檢測分析。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 版軟件進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lnc-FAM83D-3表達(dá)與預(yù)后相關(guān)性分析 乳腺癌在TCGA數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)存1 097例有可用數(shù)據(jù)的樣本，其中成對(duì)組織(癌組織與癌旁組織)數(shù)據(jù)一共有112例，有病理信息且有癌組織RNAseq數(shù)據(jù)的樣本有1 090例。與癌旁組織相比，lnc-FAM83D-3在乳腺癌組織中表達(dá)水平較高，見圖1。進(jìn)一步采用Kaplan-Meier生存分析顯示,lnc-FAM83D-3高表達(dá)患者的10年總生存率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)，見圖2。

圖1 乳腺癌和癌旁組織中Lnc-FAM83D-3相對(duì)表達(dá)水平

圖2 lnc-FAM83D-3表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系

2.2 TNBC組織及乳腺癌細(xì)胞的lnc-FAM83D-3表達(dá)水平 本院6例TNBC患者的癌旁組織與癌組織中l(wèi)nc-FAM83D-3表達(dá)量分別為(0.25±0.06)和(0.49±0.11)，P=0.002，見圖3A。

正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A、TNBC細(xì)胞系HCC-1973及TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231中l(wèi)nc-FAM83D-3表達(dá)水平分別為(0.08±0.01)、(0.36±0.11)、(0.42±0.09)，兩組TNBC細(xì)胞系中l(wèi)nc-FAM83D-3表達(dá)量相較正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量MCF-10Avs.HCC-1973，P=0.009；MCF-10Avs.MDA-MB-231，P=0.003，見圖3B。

3A：TNBC癌旁組織與癌組織中l(wèi)nc-FAM83D-3的相對(duì)表達(dá)水平，**P<0.01；3B：MCF-10A，HCC1973和MDA-MB-231細(xì)胞系中l(wèi)nc-FAM83D-3的相對(duì)表達(dá)水平，**P<0.01圖3 Lnc-FAM83D-3的相對(duì)表達(dá)水平

2.3 lnc-FAM83D-3在細(xì)胞內(nèi)的定位情況 FISH結(jié)果顯示，lnc-FAM83D-3幾乎均表達(dá)于HCC1973細(xì)胞的胞漿中，見圖4。

4A：紅色熒光標(biāo)記的lnc-FAM83D-3；4B：DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核；4C：Merge顯示lnc-FAM83D-3定位圖4 lnc-FAM83D-3在細(xì)胞內(nèi)定位情況

2.4 lnc-FAM83D-3的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 lnc-FAM83D-3的表達(dá)水平在不同腫瘤分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及病理分期的患者中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而lnc-FAM83D-3水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 lnc-FAM83D-3表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 干擾lnc-FAM83D-3表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 使用慢病毒lnc-FAM83D-3 siRNA分別轉(zhuǎn)染HCC1937細(xì)胞和MB-231細(xì)胞。篩選后繼續(xù)培養(yǎng)，第4天shNC、攜帶shlncRNA干擾片段的shlncRNA組HCC1937的細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(6 328±243)vs.(4 692±541)，P=0.003，見圖5A；MTT試驗(yàn)中兩組OD值分別為(0.552±0.001)vs.(0.403±0.001)，P<0.001，見圖5B；shNC、shlncRNA組MDA-MB-231的增殖細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(3 587±69)vs.(613±20)，P<0.001，見圖5C；MTT試驗(yàn)中，兩組OD值分別為(0.555±0.003)vs.(0.307±0.003)，P<0.001，見圖5D。提示降低lnc-FAM83D-3表達(dá)可削弱乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。

2.6 lnc-FAM83D-3與TNBC細(xì)胞株凋亡的關(guān)系 FACS檢測發(fā)現(xiàn)HCC1937細(xì)胞在shNC、shlncRNA組的凋亡比例分別為(3.17±0.06)vs.(9.60±0.20)，P<0.001,見圖6A；MDA-MB-231細(xì)胞在shNC、shlncRNA組中凋亡比例為(2.47±0.06 )vs.(10.70±0.10)，P<0.001，見圖6B。上述結(jié)果表明抑制lnc-FAM83D-3表達(dá)可促進(jìn)HCC1937和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。

5A：shNC、shlncRNA組HCC1937細(xì)胞的計(jì)數(shù)，**P<0.01；5B：shNC、shlncRNA組HCC1937細(xì)胞的MTT試驗(yàn)，**P<0.01；5C：shNC、shlncRNA組MDA-MB-231細(xì)胞的計(jì)數(shù)，**P<0.01；5D：shNC、shlncRNA組MDA-MB-231細(xì)胞的MTT試驗(yàn)，**P<0.01圖5 lnc-FAM83D-3表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞增殖的影響

6A:shNC、shlncRNA組HCC1937細(xì)胞的凋亡比例，**P<0.01；6B:shNC、shlncRNA組MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡比例，**P<0.01圖6 lnc-FAM83D-3表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響

2.7 lnc-FAM83D-3對(duì)TNBC細(xì)胞株遷移和侵襲能力的影響 shNC、shlncRNA組HCC1937、的遷移率為(97.50%±2.70%)vs.(63.59%±2.59%)，P<0.001，見圖7A；shNC、shlncRNA組MDA-MB-231的遷移率為(50.08%±2.44%)vs.(27.40%±6.23%)，P=0.004，見圖7B。

侵襲實(shí)驗(yàn)中shNC、shlncRNA組HCC1937的侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)為(299.53±6.29)vs.(94.67±2.54)，P<0.001,見圖8A；shNC、shlncRNA組MDA-MB-231的侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)為(201.34±2.80)vs.(63.52±1.22)，P<0.001，見圖8B。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)lnc-FAM83D-3表達(dá)降低，TNBC細(xì)胞的遷移能力與侵襲能力降低。

7A：shNC、shlncRNA組HCC1937細(xì)胞的遷移率，**P<0.01；7B：shNC、shlncRNA組MDA-MB-231細(xì)胞的遷移率，**P<0.01圖7 lnc-FAM83D-3水平對(duì)TNBC細(xì)胞遷移能力的影響

8A：侵襲實(shí)驗(yàn)中，shNC、shlncRNA組HCC1937細(xì)胞的計(jì)數(shù),**P<0.01；8B：侵襲實(shí)驗(yàn)中，shNC、shlncRNA組MDA-MB-231細(xì)胞的計(jì)數(shù)，**P<0.01圖8 Lnc-FAM83D-3水平對(duì)TNBC細(xì)胞侵襲能力的影響

2.8 lnc-FAM83D-3和miR-504-3p的靶向關(guān)系

使用DIANA、miRDB、RNA22等生物信息學(xué)預(yù)測軟件分析，miR-504-3p可能是lnc-FAM83D-3下游潛在作用靶點(diǎn)，見圖9A。starBase預(yù)測顯示lnc-FAM83D-3與miR-504-3p間的結(jié)合位點(diǎn)，見圖9B。

9A：生物信息學(xué)預(yù)測lnc-FAM83D-3潛在作用的miRNA；9B：lnc-FAM83D-3和miR-504-3p的結(jié)合位點(diǎn)圖9 lnc-FAM83D-3與miRNA-504-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)

shNC組和shlncRNA組HCC1937、MDA-MB-231的miR-504-3p相對(duì)表達(dá)量分別為(0.19±0.05)vs.(0.48±0.04)，P=0.002;(0.25±0.05)vs.(0.53±0.13)，P=0.02，見圖10。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與單轉(zhuǎn)染野生型lnc-FAM83D-3的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染野生型lnc-FAM83D-3和miR-504-3p載體的細(xì)胞(1.00±0.21)vs.(0.51±0.07)，P=0.018，熒光素酶活性降低，見圖11。

圖10 lnc-FAM83D-3水平對(duì)miR-504-3p表達(dá)的影響，*P<0.05

圖11 雙熒光素酶報(bào)告基因，*P<0.05

2.9 lnc-FAM83D-3調(diào)控miR-504-3p對(duì)TNBC細(xì)胞功能的影響 將細(xì)胞分為同時(shí)干擾lnc-FAM83D-3表達(dá)和使用miR-504-3p抑制劑的shlncRNA+miR-inhibitor組、僅使用miR-504-3p抑制劑的miR-inhibitor組和對(duì)照miR-NC組。FACS發(fā)現(xiàn)，shlncRNA組相比shlncRNA+miR-inhibitor組，HCC1937的凋亡比例為(2.50±0.30)vs.(10.80±1.67)，P=0.001；MDA-MB-231的凋亡比例為(2.51±0.30)vs.(10.08 ±1.80)，P=0.002，見圖12。

MTT試驗(yàn)第4天，shlncRNA+miR-inhibitor組與shlncRNA組HCC1937的OD值分別為(0.64±0.08)vs.(0.42±0.07)，P=0.024；shlncRNA+miR-inhibitor組與shlncRNA組MDA-MB-231的OD值分別為(0.72±0.13)vs.(0.30±0.04)，P=0.005。結(jié)果顯示，在干擾lnc-FAM83D-3表達(dá)的細(xì)胞株中，抑制miR-504-3p表達(dá)會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，見圖13。

劃痕實(shí)驗(yàn)中，shlncRNA組對(duì)比shlncRNA+miR-inhibitor組，HCC1937遷移率分別為(60.1±13.0)vs.(93.5±12.2)，P=0.033和MDA-MB-231遷移率分別為(27.3±4.2)vs.(53.3±12.7)，P=0.028，遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖14。

侵襲實(shí)驗(yàn)中，shlncRNA+miR inhibitor組與shlncRNA組HCC1937細(xì)胞株侵襲細(xì)胞的計(jì)數(shù)分別為(106.2±15.5)vs.(230.3±30.4)，P=0.003，MDA-MB-231細(xì)胞株中，兩組的計(jì)數(shù)分別為(59.1±12.2)vs.(150.8±13.0)，P=0.001，見圖15。由此可見，lnc-FAM83D-3通過負(fù)向調(diào)控miR-504-3p表達(dá)，抑制TNBC細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

12A：shNC組、shlncRNA組、shlncRNA+miR-inhibitor組、shlncRNA+miR NC組HCC1937細(xì)胞的凋亡比例,** P<0.01；12B：shNC組、shlncRNA組、shlncRNA+miR-inhibitor組、shlncRNA+miR NC組MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡比例，** P<0.01圖12 lnc-FAM83D-3與miR-504-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

13A：MTT試驗(yàn)中shNC組、shlncRNA組、shlncRNA+miR-inhibitor組、shlncRNA+miR NC組HCC1937細(xì)胞的OD值,*P<0.05；13B：MTT試驗(yàn)中shNC組、shlncRNA組、shlncRNA+miR-inhibitor組、shlncRNA+miR NC組MDA-MB-231細(xì)胞的OD值，** P<0.01圖13 lnc-FAM83D-3與miR-504-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

14A：shNC組、shlncRNA組、shlncRNA+miR-inhibitor組、shlncRNA+miR NC組HCC1937細(xì)胞的遷移率，*P<0.05；14B：shNC組、shlncRNA組、shlncRNA+miR-inhibitor組、shlncRNA+miR NC組MDA-MB-231細(xì)胞的遷移率，*P<0.05圖14 lnc-FAM83D-3與miR-504-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

圖15 lnc-FAM83D-3與miR-504-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響**P<0.01

2.10 miR-504-3p對(duì)FAM83D蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)Targetscan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83D可能是miR-504-3p下游的潛在作用靶點(diǎn)，見圖16。

圖16 Targetscan軟件預(yù)測FAM83D為下游作用靶點(diǎn)

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)，與FAM83D 3′UTR 突變型細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-504-3p載體的FAM83D 3′UTR 野生型細(xì)胞熒光素酶活性降低(P=0.000 5)，見圖17。

圖17 雙熒光素酶報(bào)告基因

Western bolt結(jié)果顯示，減少miR-504-3p表達(dá)后FAM83D的蛋白表達(dá)水平增加，干擾Lnc-FAM83D-3表達(dá)后FAM83D的表達(dá)明顯降低，而shlncRNA+miR-inhibitor組較shlncRNA組FAM83D表達(dá)上升，見圖18。

圖18 各組HCC1937細(xì)胞的FAM83D水平

3 討論

乳腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程涉及諸多基因及信號(hào)通路的異常。其中部分lncRNAs已被證實(shí)參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的多個(gè)過程，還可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及凋亡等多種生物信息學(xué)過程。但仍有部分lncRNAs在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制尚未闡明，因而本研究積極探尋與乳腺癌患者生存相關(guān)的lncRNAs并探究其可能調(diào)控機(jī)制，為三陰性乳腺癌的靶向治療提供潛在靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，lnc-FAM83D-3在三陰性乳腺癌患者癌組織、三陰性乳腺癌細(xì)胞HCC1937、MDA-MB-231中的表達(dá)量較癌旁組織、正常人乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A的表達(dá)量增加，這與既往在TCGA數(shù)據(jù)庫樣本中的統(tǒng)計(jì)結(jié)論基本一致。干擾lnc-FAM83D-3的表達(dá)后，HCC1937、MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，凋亡比例增加。說明lnc-FAM83D-3在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著促癌的作用。

對(duì)于miR-504-3p的作用，目前還不明確，但一些研究證實(shí)在腎胚細(xì)胞瘤中，BLACAT2 能夠通過降低miR-504-3p表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長，抑制其凋亡[12]。在急性髓系白血病中，miR-504-3p通過抑制MTHFD2表達(dá)發(fā)揮抑癌作用[13]。綜上所述，miR-504-3p在腎胚細(xì)胞瘤、急性髓性白血病中都發(fā)揮了抑癌作用，并可能作為判斷患者預(yù)后的獨(dú)立因子。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測顯示miR-504-3p可能是lnc-FAM83D-3的下游潛在作用位點(diǎn)，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)lnc-FAM83D-3競爭性結(jié)合并吸附miR-504-3p。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)降低miR-504-3p表達(dá)可明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，提示miR-504-3p可通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡過程進(jìn)而參與其發(fā)展過程。

FAM83家族(Family with sequence similarity 83)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。其中研究較多的是微管結(jié)合蛋白FAM83D。Yan等[14]闡述了miRNA-495通過靶向調(diào)節(jié)FAM83D抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用。Yin等[15]證實(shí)FAM83D可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和順鉑耐藥。除此以外，還有研究[16-17]證明FAM83D的過度表達(dá)與肝癌、卵巢癌、食管癌的惡性生物學(xué)活性相關(guān)。在既往的生物信息學(xué)研究[18]與RNA序列和微陣列數(shù)據(jù)挖掘[19]中，都提示FAM83D可能與三陰性乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。這與本研究的結(jié)果相吻合。

綜上，lnc-FAM83D-3在HCC1937和MDA-MB-231細(xì)胞中高表達(dá)，lnc-FAM83D-3可通過靶向調(diào)控miR-504-3p-FAM83D軸而影響乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡。該分子的表達(dá)水平可以作為預(yù)后判斷以及疾病轉(zhuǎn)歸的預(yù)測指標(biāo)，也為三陰性乳腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。但關(guān)于lnc-FAM83D-3 的體內(nèi)試驗(yàn)及其在臨床診斷中的應(yīng)用仍需深入研究。