牛碩，朱梅君，魏子貢

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430062)

0 引言

甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母(Pichiapastoris)作為目前生產(chǎn)重組蛋白最重要的表達(dá)系統(tǒng)之一，具有分子遺傳簡(jiǎn)單、能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾等優(yōu)點(diǎn)[1]．隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在基因水平對(duì)畢赤酵母進(jìn)行基因改造成為研究畢赤酵母基因功能的主要手段．

對(duì)于酵母菌的遺傳操作中，經(jīng)常使用標(biāo)記基因來篩選重組菌株，然而目前應(yīng)用廣泛的標(biāo)記基因主要是編碼抗生素的基因[2]．對(duì)于畢赤酵母而言，能夠被實(shí)際運(yùn)用于基因工程的標(biāo)記基因數(shù)量有限，而且進(jìn)行多次基因操作時(shí)，由于可供選擇的篩選標(biāo)記會(huì)受到限制，所以在篩選經(jīng)過多次基因修飾的重組菌株時(shí)就會(huì)相對(duì)困難．利用多個(gè)標(biāo)記基因篩選重組菌株也會(huì)增加前期載體構(gòu)建的復(fù)雜程度，因此有效地消除標(biāo)記基因可以克服這些難題．

利用反向篩選標(biāo)記實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記基因操作的方法為微生物基因工程研究提供了新的工具[3]．在微生物領(lǐng)域中，目前常用的反向篩選標(biāo)記包括大腸桿菌(Escherichiacoli)中編碼半乳糖激酶的galK基因，galK基因的表達(dá)令E.coil菌株對(duì)2-脫氧半乳糖敏感，在2-脫氧半乳糖存在時(shí)，中間代謝2-脫氧半乳糖-1-磷酸會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]；E.coil中mazF基因編碼毒素蛋白MazF，MazF是一種序列特異性核酸內(nèi)切酶，作為mRNA干擾酶，識(shí)別mRNA的ACA序列，拆開單鏈mRNA，從而阻斷蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻[5-6]；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的URA3基因編碼乳清苷酸脫羧酶，該酶是合成尿嘧啶的關(guān)鍵酶，可催化5-FOA(5-氟乳清酸)轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]．以上的研究表明，無標(biāo)記基因操作體系在分子生物學(xué)中的重要作用以及廣泛應(yīng)用．利用無標(biāo)記基因操作的方法可以實(shí)現(xiàn)基因的敲入、敲除、定點(diǎn)突變等基因操作[8]，篩選標(biāo)記回收后還可以重復(fù)利用，從而對(duì)同一個(gè)宿主菌株進(jìn)行多次基因修飾且不會(huì)引入多余的標(biāo)記基因．

雷帕霉素(Rapamycin，RAPA),又名西羅莫司，屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，為低毒性抗真菌藥物．使用雷帕霉素處理酵母后，細(xì)胞周期不可逆轉(zhuǎn)地停滯在G1期，阻斷細(xì)胞周期由G1期至S期的進(jìn)程[9]．本研究通過參考Zhu等[10]利用轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)構(gòu)建畢赤酵母突變文庫的方法，建立了百萬級(jí)別的突變庫，通過篩選獲得具有雷帕霉素抗性的畢赤酵母突變株mut375．通過熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR)實(shí)驗(yàn)確定了突變株的突變位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座子插入了PAS_Chr2-2_0375基因，導(dǎo)致該基因的功能缺失．由于畢赤酵母PAS_Chr2-2_0375基因表達(dá)產(chǎn)物與釀酒酵母的FPR1基因產(chǎn)物有高度同源性，因此將該基因命名為kFPR1．

實(shí)驗(yàn)表明kFPR1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致畢赤酵母產(chǎn)生雷帕霉素抗性表型，把攜帶kFPR1基因片段的表達(dá)載體pGAPZB-kFPR1轉(zhuǎn)化至KO菌株，發(fā)現(xiàn)重組菌株恢復(fù)了對(duì)雷帕霉素的敏感性．將突變株mut375與野生型畢赤酵母GS115菌株在YPD固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行對(duì)比，突變株與野生型酵母的生長(zhǎng)情況相近，表明kFPR1基因的缺失并不會(huì)影響畢赤酵母的生長(zhǎng)，這些結(jié)果顯示kFPR1基因具有作為畢赤酵母反向篩選標(biāo)記的特性．以EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)作為目的蛋白，博來霉素抗性基因(ZeoR)和kFPR1分別作為正向篩選標(biāo)記和反向篩選標(biāo)記，成功將EGFP基因整合至畢赤酵母染色體上并且回收了篩選標(biāo)記片段ZeoR-kfpr1，證明了kFPR1作為畢赤酵母反向篩選標(biāo)記的可行性．

本研究利用轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)篩選得到具有雷帕霉素的突變體，并證明了畢赤酵母kFPR1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致畢赤酵母產(chǎn)生雷帕霉素抗性表型，可以通過導(dǎo)入攜帶kFPR1基因的表達(dá)載體恢復(fù)對(duì)雷帕霉素的敏感性.因此，利用kFPR1基因作為反向篩選標(biāo)記，建立了一種適用于畢赤酵母的無標(biāo)記基因操作方法，為畢赤酵母的遺傳操作提供了新的篩選工具.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本研究所用的畢赤酵母菌株見表1，畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZB、pPICZA及大腸桿菌克隆載體pVAX1均購(gòu)自Invitrogen公司，重組載體pPICZA-EGFP由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建.

表1 本研究使用畢赤酵母菌株

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 大腸桿菌生長(zhǎng)所用LB培養(yǎng)基含0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1%氯化鈉；畢赤酵母生長(zhǎng)所用完全培養(yǎng)基(YPD)或選擇性培養(yǎng)基(YND、YPDZ和YPDR)．YPD培養(yǎng)基含1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖；YND培養(yǎng)基含0.17%酵母氮源基礎(chǔ)(無氨基酸無硫酸銨)，0.5%硫酸銨，1%葡萄糖；YPDZ培養(yǎng)基即YPD培養(yǎng)基中添加100 μg/mL 博來霉素；YPDR培養(yǎng)基即YPD培養(yǎng)基中添加100 ng/mL雷帕霉素；酵母裂解液含0.2 mol/L 醋酸鋰，0.5 mol/L氯化鈉，0.01 mol/L EDTA(pH8.0)，0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8. 0)，1% SDS．

1.1.3 引物 本研究使用的引物見表2．

表2 本研究所用引物

1.2 方法

1.2.1 突變株mut375的篩選與分離 利用轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)構(gòu)建畢赤酵母細(xì)胞GS115的突變體庫[10]，將輔助型質(zhì)粒和供體型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布至YND固體培養(yǎng)基，收集平板上的菌落，將獲得的酵母菌液富集后形成突變庫．取少量菌液分別涂布至YPDR固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，得到能夠在YPDR培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的突變株，命名為mut375．

1.2.2 獲取突變株mut375中轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列 將具有雷帕霉素抗性的突變體單菌落在YPDR培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.8～1.0時(shí)，取1 mL菌液，使用酵母裂解法提取突變體基因組DNA[11]，分別以LAD1-1/SBp1和AC1/SBp2為引物，通過熱不對(duì)稱交錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(TAIL-PCR)得到轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，具體PCR程序參考Liu等[12]的研究．將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從而獲得mut375突變株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列(見圖1)．

圖1 獲取轉(zhuǎn)座子側(cè)翼序列

1.2.3 轉(zhuǎn)座子在染色體上的插入位點(diǎn) 利用生物信息學(xué)網(wǎng)站NCBI(national center for biotechnology information)在線BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)將mut375突變株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼序列與畢赤酵母GS115基因組文庫進(jìn)行比對(duì)，得到轉(zhuǎn)座子在染色體上的插入位點(diǎn)．

1.2.4 pVAX1-HIS4-kfpr1HA載體的構(gòu)建 為了敲除畢赤酵母的kFPR1基因，本研究構(gòu)建了攜帶HIS4基因表達(dá)盒的同源臂片段．用EcoRI和XhoI消化質(zhì)粒pVAX1，膠回收線性化片段；以畢赤酵母GS115基因組DNA為模板，使用kfpr1HA-UP-F/kfpr1HA-UP-R引物擴(kuò)增得到kfpr1HA-Up片段，該片段為648 bp的kFPR1基因上游同源序列；使用kfpr1HA-DO-F/kfpr1HA-DO-R引物擴(kuò)增得到kfpr1HA-DO片段，該片段為552 bp的kFPR1基因上游同源序列;以pPIC9K質(zhì)粒為模板，使用His4-F/His4-R引物擴(kuò)增得到His4-up/do片段．回收上述擴(kuò)增得到DNA片段，參照CloneExpress? MulitS One Step Cloning試劑盒的說明書的操作步驟將這4個(gè)DNA片段無縫連接，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，用添加了氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，使用Plasmid Mini kit I(Omega)提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒命名為pVAX1-HIS4-kfpr1HA(圖2)．

1.2.5kFPR1基因缺失的KO菌株 質(zhì)粒pVAX1-HIS4-kfpr1HA用EcoRI和XhoI酶消化，釋放HIS4- kfpr1HA片段，膠回收酶切產(chǎn)物，將HIS4-kfpr1HA片段轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至YND固體培養(yǎng)基．利用同源重組將該片段整合至kFPR1基因處，實(shí)現(xiàn)kFPR1基因的敲除.挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子即為kFPR1基因缺失的KO菌株．

1.2.6 pGAPZB-kfpr1載體的構(gòu)建及功能回補(bǔ)的TR菌株 以GS115基因組DNA為模板，使用ExkFPR1-F/ExkFPR1-R引物擴(kuò)增kfpr1片段，與EcoRI和XhoI雙酶切處理pGAPZB質(zhì)粒的回收產(chǎn)物無縫連接，得到pGAPZB-kfpr1載體．用AvrII消化pGAPZB-kfpr1質(zhì)粒，得到線性化的pGAPZB-kfpr1載體，轉(zhuǎn)化至KO菌株制備的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后得到kFPR1基因功能回補(bǔ)的TR菌株．

1.2.7 構(gòu)建pPICZA-EGFP-CYC1TT-kfpr1載體 以pPICZA質(zhì)粒為模板，使用Cyctt-F/Cyctt-R引物擴(kuò)增CYC1TT片段；以pGAPZB-kfpr1質(zhì)粒為模板，使用pGAP-F/kfpr1-R引物擴(kuò)增pGAP-kfpr1片段；用EcoRI和XbaI消化pPICZA-EGFP質(zhì)粒的膠回收產(chǎn)物，3個(gè)DNA片段進(jìn)行無縫連接，得到pPICZA-EGFP-CYC1TT-kfpr1質(zhì)粒．

1.2.8kFPR1基因反向篩選標(biāo)記的應(yīng)用實(shí)驗(yàn) 用限制性內(nèi)切酶PmeI消化pPICZA-EGFP-CYC1TT-kfpr1質(zhì)粒，將線性化的載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KO菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布至YPDZ培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)2 d．經(jīng)PCR實(shí)驗(yàn)鑒定后，得到重組菌株EGFP-ZeoR-kfpr1-KO．將EGFP-kfpr1-GS115菌株在YPD培養(yǎng)基中連續(xù)傳代兩次后，稀釋涂布至YPDR培養(yǎng)基平板上篩選具有雷帕霉素抗性的單菌落，通過測(cè)序確認(rèn)單菌落的基因型(圖3)．

圖3 kFPR1基因作為反向篩選標(biāo)記的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

2 結(jié)果

2.1 突變株mut375的分離及表型分析通過轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)對(duì)畢赤酵母GS115菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變，富集得到酵母突變庫．經(jīng)過篩選獲得了能夠在含有雷帕霉素的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的突變株mut375．分離單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，在YPDR培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的情況如圖4所示．

圖4 mut375在YPDR培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.2 確定mut375突變株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)對(duì)TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，利用Internet BLAST在線工具將轉(zhuǎn)座子側(cè)翼序列與畢赤酵母GS115基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的插入破壞了PAS_Chr2-2_0375基因(NCBI Gene ID：8199086)開放閱讀框的完整性．該基因大小為414 bp，表達(dá)產(chǎn)物是由137個(gè)氨基酸組成，具有肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶活性，能夠結(jié)合FK506免疫抑制類藥物．與人(Homosapiens)的FKBP 1B蛋白氨基酸序列具有55.24%的同源性，與釀酒酵母的FPR1蛋白氨基酸序列有76%的同源性，因此將畢赤酵母中的PAS_Chr2-2_0375基因命名為kFPR1．

2.3kFPR1基因缺失菌株KO與功能回補(bǔ)菌株TR的表型結(jié)果本研究用畢赤酵母的HIS4基因通過同源重組替換GS115菌株的kFPR1基因(圖5A)，得到kFPR1基因缺失的突變株KO(表1)．通過體外構(gòu)建pGAPZB-kfpr1表達(dá)載體，并整合至菌株KO的染色體上，得到kFPR1基因功能回補(bǔ)菌株TR(表1)．kFPR1基因缺失的KO菌株與mut375突變株具有相同表型，均能夠在含雷帕霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而功能回補(bǔ)菌株TR則不具備雷帕霉素抗性,與野生型畢赤酵母X33菌株的表型一致(圖5B)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明kFPR1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致畢赤酵母產(chǎn)生雷帕霉素抗性，回補(bǔ)kFPR1基因的功能會(huì)恢復(fù)畢赤酵母對(duì)雷帕霉素的敏感性．

圖5 kFPR1基因缺失突變菌株KO與功能回補(bǔ)菌株TRA：畢赤酵母kFPR1基因的敲除．B：突變株mut375、KO及TR菌株在YPDR培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況.

2.4kFPR1基因作為畢赤酵母反向篩選標(biāo)記的應(yīng)用將線性化的pPICZA-EGFP-CYC1TT-kfpr1載體整合到畢赤酵母KO菌株的染色體上，使用博來霉素篩選得到重組菌株EGFP-ZeoR-kfpr1-KO．再利用kFPR1基因作為反向篩選標(biāo)記，使用雷帕霉素篩選得到ZeoR-kfpr1片段丟失的重組菌株EGFP-KO，實(shí)現(xiàn)了篩選標(biāo)記的回收(見圖6A)．使用甲醇誘導(dǎo)EGFP-KO菌株表達(dá)目的蛋白，并在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況(見圖6B)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究以kFPR1作為反向篩選標(biāo)記，不僅成功將EGFP表達(dá)盒成功整合至畢赤酵母基因組中，并且沒有引入標(biāo)記基因，實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的無標(biāo)記基因操作．

圖6 重組菌株EGFP-KO的表型分析A：重組菌株EGFP-ZeoR-kfpr1-KO和EGFP-KO在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表型．B：菌株EGFP-KO中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況.

3 討論

以畢赤酵母內(nèi)源性基因kFPR1作為反向篩選標(biāo)記，博來霉素抗性基因ZeoR作為正向篩選標(biāo)記，成功將報(bào)告基因EGFP整合至酵母染色體，且回收了ZeoR-kfpr1標(biāo)記單元．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明kFPR1基因可以作為畢赤酵母的反向篩選標(biāo)記，為畢赤酵母的無標(biāo)記基因操作提供了新的工具．

相比于同樣適用于畢赤酵母的反向篩選標(biāo)記mazF，kFPR1的局限性在于目前只適用于畢赤酵母而且需要先對(duì)畢赤酵母kFPR1基因進(jìn)行敲除，其優(yōu)點(diǎn)在于kFPR1基因產(chǎn)物不影響畢赤酵母的生長(zhǎng)代謝．mazF基因產(chǎn)物會(huì)抑制畢赤酵母的生長(zhǎng)，需要使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子AOX1p嚴(yán)緊調(diào)控mazF基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此反向篩選時(shí)需要加入甲醇誘導(dǎo)，以甲醇為唯一碳源時(shí)，畢赤酵母的生長(zhǎng)速度緩慢．畢赤酵母作為表達(dá)外源蛋白的工程菌，常常使用AOX1啟動(dòng)子調(diào)控目的基因的表達(dá)，會(huì)與反向篩選標(biāo)記mazF的使用產(chǎn)生沖突，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果．而kFPR1作為反向篩選標(biāo)記只需要在含雷帕霉素的平板上進(jìn)行篩選，操作更簡(jiǎn)便．

本研究開發(fā)了一種適用于畢赤酵母的反向篩選標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)篩選標(biāo)記在基因操作過程中的回收以及靶基因的成功整合，克服了篩選標(biāo)記選擇的限制，便于對(duì)同一宿主菌株進(jìn)行多次基因編輯且不會(huì)引入抗生素抗性，建立了適用于畢赤酵母的無標(biāo)記基因操作體系．