王曉睿，胡琴，杜雪竹，盛鋒

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

水稻是世界三分之一以上人口的主食，提供的熱量占絕大多數(shù)人每日攝入熱量的80%[1]. 據(jù)統(tǒng)計(jì)，在種植水稻的過程中，水稻的產(chǎn)量潛力本可達(dá)10 t/hm2，但當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的平均收獲量僅在4～5 t/hm2之間[2]. 水稻產(chǎn)量的巨大差距歸因于各種環(huán)境脅迫對(duì)水稻生長造成的負(fù)面影響[3]. 近年來，由于農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的日益惡劣以及全球極端氣候的頻繁發(fā)生，非生物逆境如干旱、高鹽、低溫、高溫等成為限制水稻產(chǎn)量增長的主要因素. 因此進(jìn)一步挖掘水稻抗逆相關(guān)基因資源，實(shí)現(xiàn)抗逆功能基因研究向抗逆育種應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，對(duì)保障水稻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展以及國家糧食安全具有重要的意義[4-5]. DUF(domain of unknown function)家族，是指含有未知功能域的蛋白質(zhì)家族[6]，Pfam數(shù)據(jù)庫現(xiàn)包括17 929個(gè)蛋白家族，其中近22%屬于DUFs蛋白家族[7]. 盡管解析DUFs蛋白的結(jié)構(gòu)和功能是后基因組時(shí)代所面臨的一大挑戰(zhàn)，但近年來迅速發(fā)展的基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)以及日漸豐富的分子生物學(xué)研究方法為此提供了極好的基礎(chǔ)[8].

研究表明，大量DUFs基因在植物的生長發(fā)育以及對(duì)逆境的耐受性中發(fā)揮著重要的作用. 擬南芥DUF579家族的所有成員均能夠影響植物細(xì)胞壁半纖維素主要成分木聚糖的完整性，且DUF579家族成員AGM1和AGM2是高度糖基化的阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)的葡萄糖醛酸4-O-甲基化所必需的[9-10]. 與野生型擬南芥植株相比，DUF761-1的過量表達(dá)株系表現(xiàn)出葉片變小、根系變短等表型，說明DUF761-1可能參與調(diào)控植物的營養(yǎng)器官的生長發(fā)育[11]. 在擬南芥中敲除DUF647家族成員RUS4，發(fā)現(xiàn)敲除突變體的雄蕊中相對(duì)于野生型顯著減少，JA途徑中與雄蕊和花粉成熟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MYB21、MYB24、MYB57和MYB108的表達(dá)量顯著降低[12]，暗示RUS4可能通過影響JA相關(guān)基因的表達(dá)在協(xié)調(diào)花藥開裂和花粉成熟中發(fā)揮作用[13-14]. 在水稻中過表達(dá)OsDUF946.4基因，導(dǎo)致LEA蛋白和HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)了水稻對(duì)干旱和高鹽的耐受性[15]. 以上研究說明，DUF基因家族廣泛參與植物的各種生理過程，尤其在植物生長發(fā)育以及對(duì)非生物逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用.

DUF642 蛋白是一種植物特有的未知功能的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，屬于種子植物特異蛋白，在藻類、苔蘚以及蕨類等孢子植物中并未發(fā)現(xiàn)[16]. 目前在模式植物擬南芥中共鑒定到10個(gè)DUF642基因，其他物種如玉米、水稻、煙草、小麥等陸續(xù)也有該基因家族成員的報(bào)道[17-18]. 近期有研究對(duì)擬南芥10個(gè)AtDUF642基因的組織表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位和誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，在不同的發(fā)育階段、組織或逆境刺激下，AtDUF642s表現(xiàn)出明顯的時(shí)空差異. 如在種子萌發(fā)階段，AtDGR1和At2g34510只能特異地在蔭蔽條件下的下胚軸中檢測(cè)到；在生殖生長階段，花粉囊中只能檢測(cè)到AtBDX(At4g32460)的表達(dá)；At2g34510和At5g11420在葉片中受干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但是對(duì)脫落酸沒有響應(yīng)；At1g29980和AtBDX受到根結(jié)線蟲M.incognita誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，對(duì)不能侵染擬南芥的線蟲類型N.aberrans沒有響應(yīng). 籽粒莧(Amaranthushypochon-driacus)中的AhDGR2基因在干旱和鹽脅迫下被顯著誘導(dǎo)，在擬南芥中過表達(dá)該基因后會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞壁變薄以及果膠積累異化，果膠甲酯酶活性顯著降低，根系和葉片中的細(xì)胞排列異常，根長和葉長也發(fā)生明顯變化，同時(shí)表現(xiàn)出ABA及鹽脅迫更加敏感，暗示AhDGR2可能通過調(diào)控果膠甲酯酶活性影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和完整性，從而調(diào)控植物的生長以及對(duì)非生物脅迫的耐受性[19].

基于DUF642蛋白家族在植物生命活動(dòng)中發(fā)揮的重要作用，為進(jìn)一步挖掘和鑒定水稻逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)基因，本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)水稻全基因組DUF642家族成員進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、染色體定位、啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，同時(shí)對(duì)該家族成員在不同非生物脅迫處理下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究水稻DUF642基因家族的功能提供了參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑粳稻日本晴(OryzaSativaspp.japonica)材料來自本實(shí)驗(yàn)室；Eastep? Super Total RNA Extraction試劑盒和GoScriptTMReverse Transcription Kit購自Promega公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑購自Vazyme公司.

1.2 方法

1.2.1 水稻DUF642家族基因的鑒定及理化分析 在國家水稻數(shù)據(jù)中心(http://www.ricedata.cn/gene/)和RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu)中以“DUF642”為關(guān)鍵詞搜索水稻DUF642基因家族成員；同時(shí)以擬南芥10個(gè)已確定的AtDUF642s基因?yàn)檎T餌進(jìn)行blast比對(duì)，鑒定獲得水稻全基因組中DUF642家族的所有成員及其CDS和氨基酸序列. 利用在線分析軟件在線分析工具ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)其蛋白質(zhì)理化信息進(jìn)行預(yù)測(cè). 采用在線分析軟件CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位分析. 采用MEGA6.0軟件分析水稻DUF642蛋白亞類.

1.2.2 水稻DUF642 家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 利用Clustal X軟件對(duì)水稻、擬南芥和玉米的DUF642蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)，將來源于水稻、擬南芥和玉米的DUF642蛋白進(jìn)行親緣關(guān)系分析并采用MEGA6.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，BootStrap 值設(shè)定為 1 000.

1.2.3 水稻DUF642家族染色體定位及基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 利用水稻在線數(shù)據(jù)庫RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu)查詢OsDUF642家族成員基因在染色體上的位置坐標(biāo)進(jìn)行染色體定位分析. 通過GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線分析軟件對(duì)水稻DUF642基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析并繪制基因結(jié)構(gòu)分析圖. 利用在線軟件Pfam(http://pfam.janelia.org/)對(duì)水稻DUF642基因家族的保守基序進(jìn)行分析.

1.2.4 水稻DUF642啟動(dòng)子順式元件(cis-element)分析 利用水稻在線數(shù)據(jù)庫RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu)截取6個(gè)水稻DUF642基因起始密碼子上游1 500 bp的序列，利用在線軟件PlantCARE(http://bioinformat-ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析.

1.2.5 水稻DUF642基因響應(yīng)脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)模式分析 為明確水稻DUF642基因家族對(duì)非生物逆境脅迫的應(yīng)答機(jī)制，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time PCR)法檢測(cè)水稻DUF642s響應(yīng)PEG、低溫、高鹽和脫水脅迫下的表達(dá)模式. 所用材料為粳稻日本晴，用營養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉期后進(jìn)行上述逆境處理. PEG脅迫是將三葉期幼苗放置在含10% PEG6000營養(yǎng)液中；高鹽脅迫是將三葉期幼苗放置在含200 mmol/L NaCl營養(yǎng)液中，對(duì)照材料放置在正常的營養(yǎng)液中培養(yǎng)，其他培養(yǎng)條件保持一致. 低溫脅迫是將三葉期幼苗放置在4 ℃生長箱中，對(duì)照材料在正常溫度下培養(yǎng)，其他條件保持一致. 分別在處理后0、1、3、6、12和24 h時(shí)間點(diǎn)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組葉片樣品，液氮速凍后保存在80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆? 脫水脅迫是將三葉期幼苗裸露放置在空氣中，用吸水紙吸干其根部水分，溫度、濕度和光照條件與對(duì)照組保持一致，分別在0、0.5、h、3和6 h時(shí)間點(diǎn)取樣，液氮速凍后保存在-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫籖NA提取與反轉(zhuǎn)錄：利用Eastep? Super Total RNA Extraction試劑盒(Promega)對(duì)水稻葉片總RNA進(jìn)行抽提(具體步驟請(qǐng)參照該試劑盒說明書)，將RNA保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用. 利用GoScriptTMReverse Transcription Kit(Promega)進(jìn)行cDNA合成，將cDNA保存在-20 ℃冰箱中備用. RT-qPCR分析：采用qPrimerDB - qPCR Primer Database(https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，以水稻OsActin(LOC_Os03g50885)為內(nèi)參基因(表1). 利用PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) 試劑盒，于CFX ConnectTM Real-Time System(BIO-RAD)進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，相關(guān)反應(yīng)體系以及參數(shù)設(shè)置參考試劑盒說明書. 反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線, 并采用 2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量.

表1 水稻OsDUF642s引物

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻DUF642家族鑒定及基因特征以10個(gè)擬南芥DUF642基因?yàn)樘结槪?jīng)分析和過濾從水稻基因組中共鑒定得到6個(gè)編碼包含DUF642結(jié)構(gòu)域的基因，將這些基因分別命名為OsDUF642.01～OsDUF642.06，其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目介于374～403個(gè)，分子量介于在39.85～42.26 kD，等電點(diǎn)介于4.25～9.72. 利用CELLO v.2.5和WoLF PSORT兩種軟件對(duì)OsDUF642s的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè). 結(jié)果顯示，OsDUF642.02 和 OsDUF642.03 定位于細(xì)胞外, OsDUF642.01 定位于細(xì)胞核或者細(xì)胞外, OsDUF642.04 定位于線粒體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，OsDUF642.05 定位于細(xì)胞外或者質(zhì)膜，OsDUF642.06 定位于線粒體或者細(xì)胞外. 利用MEGA6.0 軟件分析(neighbor-joining method, NJ)顯示，水稻的DUF642蛋白可以分為3個(gè)亞類，其中OsDUF642.02、OsDUF642.03和 OsDUF642.06屬于亞類I，OsDUF642.01和 OsDUF642.04屬于亞類Ⅱ，OsDUF642.05屬于亞類Ⅲ，不同成員之間的的同源性極高(表2).

表2 水稻OsDUF642s基因的序列特征

2.2 水稻、擬南芥和玉米DUF642基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建將來源于水稻、擬南芥和玉米的DUF642蛋白進(jìn)行親緣關(guān)系分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，發(fā)現(xiàn)來源于單子葉植物水稻和玉米的DUF642蛋白親緣關(guān)系更加緊密，與雙子葉植物擬南芥DUF642蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能與單、雙子葉植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以及成分的差異有關(guān). 此外，我們發(fā)現(xiàn)OsDUF642.06與擬南芥At4g32460(BIIDXI)同屬一個(gè)亞類，BIIDXI被報(bào)道參與果膠甲酯酶活性調(diào)控，從而影響擬南芥的生長以及種子的萌發(fā)[20]. OsDUF642.01與擬南芥At3g08030親緣關(guān)系較近，At3g08030被報(bào)道能夠特異性的與纖維素結(jié)合，參與纖維素的結(jié)構(gòu)修飾[21]，暗示OsDUF642.06和OsDUF642.01可能具有類似的生物學(xué)功能.

圖1 水稻、擬南芥和玉米DUF642蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 水稻DUF642基因的染色體定位在RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu)中查詢OsDUF642家族基因在染色體上的位置坐標(biāo). 如圖2所示，6個(gè)OsDUF642基因分布水稻在1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和7號(hào)染色體上. 其中，OsDUF642.05和OsDUF642.06位于第1號(hào)染色體，OsDUF642.04位于第3號(hào)染色體，OsDUF642.02和OsDUF642.03位于第4號(hào)染色體，OsDUF642.01位于第7號(hào)染色體. 此外，OsDUF642.02和OsDUF642.03在4號(hào)染色體上的位置非常接近，且具有緊密的進(jìn)化關(guān)系，因此推測(cè)，OsDUF642.02和OsDUF642.03可能為串聯(lián)復(fù)制關(guān)系.

圖2 OsDUF642s基因在水稻染色體中定位和分布情況

2.4 水稻DUF642家族基因和蛋白結(jié)構(gòu)分析利用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線分析軟件對(duì)水稻DUF642家族基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析. 結(jié)果顯示，大部分OsDUF642s基因結(jié)構(gòu)相似，均有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子(OsDUF642.01～OsDUF642.04). 此外，OsDUF642.05有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，OsDUF642.06有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子(圖3). 使用在線軟件Pfam(http://pfam.janelia.org/)對(duì)OsDUF642s進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè). 結(jié)果顯示, OsDUF642s各成員都有2個(gè)保守的DUF642結(jié)構(gòu)域(圖4). 以上結(jié)果說明OsDUF642家族內(nèi)成員在進(jìn)化上較為保守.

圖3 水稻DUF642s基因結(jié)構(gòu)

圖4 水稻DUF642s蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

2.5 水稻DUF642家族啟動(dòng)子區(qū)域分析在RGAP數(shù)據(jù)庫中下載OsDUF642s基因的上游序列，截取6個(gè)OsDUF642基因起始密碼子上游1 500 bp的序列作為啟動(dòng)子區(qū)段(ProOsDUF642s)，利用PlantCARE軟進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)分析(圖5)，并從中提取了22類與植物逆境以及激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件. 根據(jù)功能的差異可以將這22類順式作用元件分為3類：一類是各種植物激素響應(yīng)相關(guān)元件，包括脫落酸響應(yīng)元件ABRE(A)，生長素響應(yīng)元件AuxR-core和TGA element(E和T)，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif(G和 U)，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif 和P-box(I和R)；第二類是植物逆境尤其是非生物逆境響應(yīng)相關(guān)順式元件，包括各種類型的光響應(yīng)元件(B、D、J和M)，厭氧誘導(dǎo)元件ARE和GC-motif(C和K)，干旱響應(yīng)元件DRE core(H)，低溫響應(yīng)元件LTR(N)，干旱誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(O)以及防御和逆境響應(yīng)元件(S)；第三類是各種植物抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，包括HD-ZIP 1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(L), MYB類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(P)，MYC類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(Q)以及WRKY類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件 W box(V). 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)果說明了水稻DUF642基因家族可能與水稻生長發(fā)育及多種激素和脅迫相關(guān). 在22個(gè)順式元件中，脫落酸響應(yīng)元件(A)、MYB和MYC類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(P和Q)為6個(gè)ProOsDUF642s基因所共有，暗示OsDUF642s可能參與ABA介導(dǎo)的非生物逆境響應(yīng)，且MYB和MYC類轉(zhuǎn)錄因子在OsDUF642s的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用. 此外，ProOsDUF642.01和ProOsDUF642.03含有干旱響應(yīng)元件DRE core(H)，ProOsDUF642.01、ProOsDUF642.02、ProOsDUF642.03和ProOsDUF642.06含有低溫響應(yīng)元件LTR(N)；ProOsDUF642.03和ProOsDUF642.05含有干旱誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(Q)；ProOsDUF642.04含有防御和逆境響應(yīng)元件(S)，ProOsDUF642.01和ProOsDUF642.02含有HD-ZIP 1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(L)，ProOsDUF642.05和ProOsDUF642.06含有WRKY類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件W box(V). 順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，OsDUF642基因家族可能在水稻響應(yīng)非生物逆境中發(fā)揮重要作用.

圖5 水稻DUF642家族啟動(dòng)子區(qū)域分析

2.6 水稻DUF642基因非生物逆境誘導(dǎo)表達(dá)模式分析為明確OsDUF642s基因家族在水稻響應(yīng)非生物逆境中的應(yīng)答模式，我們對(duì)OsDUF642在PEG、低溫、高鹽以及脫水等脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行了分析. 采用qPrimerDB - qPCR Primer Database設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，以水稻OsActin(LOC_Os03g50885)為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR分析. 如圖6所示，在PEG處理下，所有的OsDUF642s成員都不同程度受到誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且除OsDUF642.06受PEG誘導(dǎo)先上調(diào)表達(dá)(1 h)再回到本底水平再上調(diào)表達(dá)(24 h)外，其余基因均呈現(xiàn)出先上調(diào)表達(dá)(3 h)再回到本底水平再上調(diào)表達(dá)(12 h)再回到本底水平的表達(dá)模式；其中OsDUF642.01在3 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最為顯著，達(dá)29倍；其次是OsDUF642.06在1 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)達(dá)12倍，在24 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)達(dá)15倍. 在冷處理下，除OsDUF642.06受冷誘導(dǎo)先上調(diào)表達(dá)，在3 h達(dá)到峰值后表達(dá)量逐漸下降至本地水平(12 h)然后略微上調(diào)表達(dá)外，其余OsDUF642s成員均表現(xiàn)出在冷處理下6 h表達(dá)量達(dá)到峰值，在12 h表達(dá)量下降至比Mock更低的水平，然后再上調(diào)表達(dá)；其中OsDUF642.01在24 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最為顯著，達(dá)14倍，其次是OsDUF642.02在24 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)達(dá)12倍. 在鹽脅迫下，與Mock相比，除OsDUF642.01差異表達(dá)不顯著外，其余OsDUF642s成員均不同程度受到NaCl誘導(dǎo)差異表達(dá)，且均表現(xiàn)出在3 h表達(dá)水平達(dá)到峰值逐漸下降至本底水平，個(gè)別基因在12 h和24 h與Mock相比表達(dá)量顯著下降；其中OsDUF642.06在3 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最為顯著，達(dá)12倍. 在脫水脅迫下，除了OsDUF642.06顯著受脫水脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)外，其余基因均在6 h顯著上調(diào)表達(dá)，其中OsDUF642.04最為顯著，差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)8倍(圖7). 以上結(jié)果說明，OsDUF642基因家族廣泛參與水稻對(duì)多種非生物逆境的抗性響應(yīng)中，且同一個(gè)基因?qū)Σ煌姆巧锬婢稠憫?yīng)模式有明顯差異.

圖6 水稻DUF642基因在10% PEG模擬干旱、低溫和鹽脅迫下的表達(dá)模式分析

圖7 水稻DUF642基因在脫水脅迫下的表達(dá)模式分析

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，包括水稻在內(nèi)的多種植物的全基因組序列數(shù)據(jù)庫的信息也不斷地完善和更新[22-23]. 與此同時(shí)，Pfam數(shù)據(jù)庫中DUF基因家族所占比例在近幾年也有所增加. 越來越多的研究表明，DUF基因家族參與植物的各種生命活動(dòng)，尤其是生長發(fā)育以及對(duì)各種逆境脅迫因子的響應(yīng)[24]. 利用生物信息學(xué)的方法對(duì)DUF基因家族進(jìn)行成員鑒定、理化性質(zhì)分析、順式作用元件預(yù)測(cè)，同時(shí)結(jié)合表達(dá)譜數(shù)據(jù)以及逆境脅迫下的表達(dá)分析，為了解這些DUF基因家族的起源、多樣性和生物學(xué)功能提供了參考依據(jù)[25-26]. DUF642是一個(gè)高度保守的植物特異性的未知功能細(xì)胞壁相關(guān)蛋白家族，在擬南芥中的研究表明，該基因家族可能與果膠的結(jié)構(gòu)修飾有關(guān)[20]，并且在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中起著重要作用[27].

基于DUF642基因家族在植物生長發(fā)育和非生物逆境響應(yīng)中的重要功能，本研究對(duì)水稻DUF642基因家族成員進(jìn)行了鑒定，并結(jié)合生物信息學(xué)的研究方法，對(duì)其染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的理化性質(zhì)以及啟動(dòng)子區(qū)段順式作用元件進(jìn)行了全面分析. 在水稻中共鑒定到6個(gè)DUF642家族成員(OsDUF642.01～OsDUF642.06)，分布在第1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)染色體上，其中OsDUF642.02和OsDUF642.03在4號(hào)染色體上的位置非常接近，且進(jìn)化上聯(lián)系緊密，因此推測(cè)OsDUF642.02和OsDUF642.03可能為串聯(lián)復(fù)制關(guān)系. 對(duì)來源于擬南芥、玉米和水稻的DUF642s蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)來源于單子葉植物水稻和玉米的DUF642蛋白親緣關(guān)系更加緊密，與雙子葉植物擬南芥DUF642蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能與單、雙子葉植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以及成分的差異有關(guān). 基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析表明，OsDUF642s基因結(jié)構(gòu)類似，大多都含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其編碼蛋白均包含2 個(gè)保守的 DUF642結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步說明水稻DUF642成員間在進(jìn)化上的保守性. 蛋白質(zhì)正確的亞細(xì)胞定位與其功能實(shí)施密切相關(guān)，利用多種軟件對(duì)OsDUF64s進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明大部分OsDUF64蛋白都具有細(xì)胞外定位特征，SignalP-5.0 Server軟件預(yù)測(cè)顯示6個(gè)OsDUF64蛋白均含有胞外分泌信號(hào)肽，可能與該蛋白家族參與細(xì)胞壁果膠結(jié)構(gòu)修飾相關(guān). 此外，OsDUF642.01還可能定位于細(xì)胞核，OsDUF642.04可能定位于線粒體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，OsDUF642.05 可能定位于質(zhì)膜，OsDUF642.06 可能定位于線粒體. 進(jìn)一步利用TargetP-2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對(duì)OsDUF642.01、OsDUF642.04、OsDUF642.05和OsDUF642.06的亞細(xì)胞分揀信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的分揀信號(hào)，說明了OsDUF642家族蛋白定位的復(fù)雜性，其準(zhǔn)確的亞細(xì)胞定位情況仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

進(jìn)一步對(duì)OsDUF642基因家族成員啟動(dòng)子區(qū)段順式作用元件進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，OsDUF642s啟動(dòng)子區(qū)段均含有多種植物激素響應(yīng)相關(guān)、非生物逆境響應(yīng)相關(guān)以及逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件，表明OsDUF642s在水稻響應(yīng)非生物逆境中的潛在功能. 在上述多種順式作用元件中，脫落酸響應(yīng)元件(A)、MYB和MYC類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(P和Q)為6個(gè)ProOsDUF642s基因所共有，暗示OsDUF642s可能參與ABA介導(dǎo)的非生物逆境響應(yīng)，包括干旱、高溫、鹽脅迫等[28]；且MYB和MYC類轉(zhuǎn)錄因子在OsDUF642s的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，后續(xù)研究可以通過挖掘與ProOsDUF642s直接互作的MYB和MYC類轉(zhuǎn)錄因子，解析水稻在非生物逆境刺激下調(diào)控OsDUF642s表達(dá)的分子機(jī)制. 此外，ProOsDUF642.01和ProOsDUF642.03含有干旱響應(yīng)元件DRE core(H)，ProOsDUF642.01、ProOsDUF642.02、ProOsDUF642.03和ProOsDUF642.06含有低溫響應(yīng)元件LTR(N)；ProOsDUF642.03和ProOsDUF642.05含有干旱誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(Q)；ProOsDUF642.04含有防御和逆境響應(yīng)元件(S)，ProOsDUF642.01和ProOsDUF642.02含有HD-ZIP 1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(L)，ProOsDUF642.05和ProOsDUF642.06含有WRKY類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件 W box(V). 順式作用元件分析表明OsDUF642s在ABA介導(dǎo)的抗逆響應(yīng)中可能有著相似的功能，但是其他非生物逆境響應(yīng)元件的存在可能賦予個(gè)別OsDUF642基因在水稻應(yīng)對(duì)其他非生物脅迫如低溫、厭氧脅迫等方面的不同功能；另外，個(gè)別OsDUF642s所含有的特殊轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件如HD-ZIP 1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件(L)、WRKY類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件 W box(V)等，表明其表達(dá)水平可能存在特異的調(diào)控模式.

對(duì)水稻DUF642基因家族在不同類型的非生物脅迫下的表達(dá)的分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性以及OsDUF642s對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)模式. 在PEG脅迫下，所有OsDUF642s成員都不同程度地誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，可能與其啟動(dòng)子區(qū)段均含有ABA響應(yīng)元件相關(guān)，其中OsDUF642.01在3 h與Mock相比誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)倍數(shù)最為顯著，可能與其啟動(dòng)子區(qū)段還含有干旱響應(yīng)元件DRE core相關(guān). 在冷脅迫下，所有OsDUF642s成員都不同程度地誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)倍數(shù)較高的有OsDUF642.01、OsDUF642.02、OsDUF642.03和OsDUF642.06，可能與其啟動(dòng)子區(qū)段均含有低溫響應(yīng)元件LTR(N)有關(guān). NaCl脅迫下，除OsDUF642.01差異表達(dá)不顯著外，其余OsDUF642s成員均不同程度受到NaCl誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中OsDUF642.06上調(diào)最為顯著；雖然在OsDUF642s啟動(dòng)子區(qū)段并未鑒定到直接與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，但是ABA響應(yīng)元件、HD-ZIP 1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件以及WRKY類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件 W box等均在植物響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮著重要的作用[29-30]. 在脫水脅迫下，除了OsDUF642.06顯著受脫水脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)外，其余基因均在6 h顯著上調(diào)表達(dá)，其中OsDUF642.04最為顯著，可能與OsDUF642.04啟動(dòng)子區(qū)段除了含有脫落酸響應(yīng)元件外還含有防御和逆境響應(yīng)元件(S)有關(guān). 上述結(jié)果表明，啟動(dòng)子所含有的順式作用元件類型與該基因可能參與的生理過程息息相關(guān)，這對(duì)探索DUF類基因家族功能具有重要意義. 有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)，OsDUF642.06在PEG、冷脅迫和脫水脅迫下的表達(dá)模式與其他5個(gè)基因明顯不同，推測(cè)可能與其啟動(dòng)子區(qū)段含有WRKY類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件 W box相關(guān)，挖掘與OsDUF642.06直接互作的WRKY類轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)解析其生物學(xué)功能及調(diào)控路徑具有重要意義；OsDUF642.06受PEG滲透誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，但受脫水脅迫這種極端干旱處理誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，說明OsDUF642.06在兩種水分脅迫下可能有不同的生物學(xué)功能，而水稻中也可能存在某種機(jī)制區(qū)分兩種水分脅迫類型，從而啟動(dòng)不同的OsDUF642.06響應(yīng)模式. 此外，通過非生物誘導(dǎo)表達(dá)模式分析，我們鑒定到OsDUF642.01和OsDUF642.06受PEG脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著，OsDUF642.01和OsDUF642.02受冷脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著，OsDUF642.06受NaCl脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著，OsDUF642.04受脫水脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)最為顯著，以上基因可以作為候選基因進(jìn)一步研究其在水稻抵御響應(yīng)非生物逆境中的生物學(xué)功能，并為改良水稻抗逆能力提供基因資源.