萬夢婕， 王 薇， 范秀紅

(中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院暨?？谑腥嗣襻t(yī)院皮膚性病科, 海南 海口 570208)

特應性皮炎(Atopic Dermatitis，AD)主要以皮膚干燥、瘙癢、炎癥等為特征，是一種慢性且易復發(fā)的皮膚性疾病[1]。據(jù)文獻報道，全球AD患病率成人達2%～5%[2,3]。AD因病程較長和反復發(fā)作性嚴重影響著患者的生活質量，同時對家庭及社會構成巨大負擔。目前對于AD發(fā)病機制研究較為復雜，涉及上皮屏障功能障礙、免疫系統(tǒng)過度活化、皮膚微生物群失調等方面[4]。早期研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞的免疫失衡在AD發(fā)病過程中扮演著關鍵的角色，而長的非編碼RNA(lncRNA)作為功能性大分子可充當T淋巴細胞過程的調節(jié)劑[5]。穹窿核糖核酸2-1(vault ribonucleic acid 2-1，VTRNA2-1)是一種穹頂RNA，最初被分類為microRNA前體hsa-mir-886，又稱為“Nc886”，是一種新型的lncRNA[6]。VTRNA2-1被認為是先天免疫反應中活化蛋白激酶R(protein kinaseR，PKR)的內源性調節(jié)劑，且發(fā)現(xiàn)VTRNA2-1的表達在人類CD4+激活過程中高度上調T細胞[7]。但目前在皮膚疾病中描述VTRNA2-1與 PKR的作用研究報道較少，因此，本研究探討VTRNA2-1在AD患者中的基因表達水平，分析其與PKR存在的相互作用關系。

1 對象與方法

1.1研究對象：收集2018年1月至2020年5月期間在本院皮膚科的AD患者50例為AD組，同期內另選取體檢科行健康體檢者30例設為對照組。AD組男28例，女22例，年齡22～53歲，平均(35.25±9.25)歲；對照組男14例，女16例，年齡24～55歲，平均(35.72±9.07)歲，兩組性別及年齡比較無統(tǒng)計學意義(χ2=0.655/t=0.222，P均>0.05)。納入標準：①AD患者符合《中國特應性皮炎診療指南(2020版)》診斷標準[8]；②年齡≥18歲；③患者及家屬均在知情且同意參與本研究。排除標準：①伴有其他類型皮膚疾??；②入組前一個月內曾接受過免疫抑制劑、糖皮質激素等藥物治療史；③惡性腫瘤、伴有心肝腎等器官嚴重疾病者。本實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2分組：對于符合標準的AD患者，入院后收集其特應性皮炎評分指數(shù)(Scoring Atopic Dermatitis Index，SCORAD)[9]，該評分包括A(皮損面積)、B(皮損嚴重程度評分)、C(瘙癢程度和影響睡眠程度評分)三部分。計算公式：SCORAD總分= A/5+7B/2+C，根據(jù)總分評定 AD 的嚴重程度并進行分組：輕度AD組(0～24分，n=25)，中度AD組(25～50分，n=16)，重度AD組(51～103分，n=9)。輕度AD組男15例，女10例，年齡25～53歲，平均(34.51±9.04)歲；中度AD組男10例，女6例，年齡22～50歲，平均(34.07±9.11)歲；重度AD組男3例，女6例，年齡23～50歲，平均(34.74±9.07)歲。三組性別及年齡比較無統(tǒng)計學意義(χ2=2.313/F=0.125，P均>0.05)。

1.3實驗方法

1.3.1標本采集與處理：患者入組后由熟練的護士采集AD患者和健康體檢患者外周血5mL肝素抗凝，并迅速送至實驗室進行實驗檢測。血樣本在4℃，3000rpm離心15min，收集血清樣本進行編號，分裝于干凈EP管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2外周血單個核細胞分離：取全血標本稀釋，水平轉子800g離心30min，吸取白色單核細胞層15mL放置離心管中，加入10mL細胞洗滌液再次250g離心10min，重復兩次后棄上清，細胞重懸備用，采用差異貼壁法純化細胞2～4h。細胞稀釋液充分混勻后，滴10μL到玻璃計數(shù)板上使細胞稀釋10倍后進行細胞計數(shù)，在無菌條件下通過免疫磁珠方法(130-045-101，Miltenyi Biotec，德國)從外周血單個核細胞中陽性選擇純化CD4+T細胞。

1.3.3實時熒光定量PCR檢測各組VTRNA2-1基因表達：細胞總RNA的提?。喝D4+T細胞放置冰上孵育20min，取出后室溫靜置10min，加入200μL氯仿，放入高速低溫離心機中，12000rpm離心10min，棄上清，保留底部沉淀RNA，溶解獲得總RNA，上機檢測RNA濃度及純度。逆轉錄PCR：參照相關試劑盒說明書加入試劑，混勻后低速離心20s使其沉淀，獲得RNA逆轉錄成的cDNA。VTRNA2-1基因引物序列：F：CGACCCCAGTCATAAACTATGA；R：AAGACCCCTCCCAGATAGATA。采用7500 Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)(品牌：賽默飛世爾)進行擴增，-ΔΔCt法計算VTRNA2-1基因相對表達率。

1.3.4Western blot檢測CD4+T細胞VTRNA2-1蛋白表達：取細胞懸液進行總蛋白質的提取，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒(產地：中國/上海；品牌：澤葉生物)操作說明書進行蛋白質定量，將配制好的蛋白緩沖液放置于95℃以上水浴加熱10min至蛋白質變性后，冷卻離心10min，-80℃保存。根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠試劑盒中的說明書制備凝膠進行凝膠電泳和凝膠成像，利用Image Lab軟件分析條帶灰度值，計算VTRNA2-1蛋白質相對表達量。

1.3.5免疫共沉淀實驗分析VTRNA2-1蛋白與其相互作用蛋白：使用試劑盒提取總蛋白質進行蛋白質定量，置-80℃保存，脫硫生物素標記體外轉錄的VTRNA2-1與素磁珠和鏈霉親結合，再與正常細胞質蛋白裂解液孵育，裂解細胞以13000r/min離心15min得到蛋白上清液，后加入洗脫液洗脫去除雜蛋白，通過Western blotting實驗進行驗證。

2 結 果

2.1AD組與對照組VTRNA2-1基因相對表達量比較：AD組患者外周血CD4+T淋巴細胞中VTRNA2-1基因表達水平為1.55±0.19，對照組為0.77±0.32，兩組比較，AD組患者VTRNA2-1表達呈高水平狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 AD組與對照組VTRNA2-1基因表達水平比較

2.2不同程度AD患者VTRNA2-1基因相對表達量比較：輕度AD組患者外周血CD4+T淋巴細胞中VTRNA2-1表達水平為1.22±0.19，中度AD組為1.55±0.11，重度為1.79±0.12，不同組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同程度AD患者VTRNA2-1基因表達水平比較

圖3 SCORAD評分與VTRNA2-1基因表達水平關系分析

2.3SCORAD評分與VTRNA2-1基因相對表達量的關系：Pearson相關性分析結果顯示，AD患者SCORAD評分越高，其外周血CD4+T淋巴細胞中VTRNA2-1表達水平也隨之升高，兩者存在明顯的正相關，見圖3。

2.4VTRNA2-1蛋白水平及其直接作用蛋白：免疫共沉淀實驗結果顯示，CD4+T細胞中有蛋白激酶R(protein kinaseR，PKR)蛋白的表達，此實驗方法得到的PKR蛋白質在細胞內與VTRNA2-1特異性結合。AD組患者CD4+T細胞中 VTRNA2-1和PKR的蛋白表達量較對照組高(P<0.05)，見圖4和表1。

圖4 蛋白質印跡法檢測VTRNA2-1和PKR蛋白

表1 AD組與對照組VTRNA2-1和PKR蛋白表達水平

3 討 論

參與AD病理過程的細胞種類有很多，其中CD4+T細胞亞群在介導內源性AD中發(fā)揮著更為重要的作用，當表皮細胞破損后分泌胸腺基質淋巴細胞生成素，激活固有淋巴細胞使其分泌Th2型細胞炎癥因子，從而促使AD引起炎癥反應，而這些炎癥因子又會與肥大細胞等相互作用，進而加重炎癥反應[10]。限于AD當前治療手段的有限性，有必要進一步深入研究AD的發(fā)病機制，為臨床提供更佳的治療靶點。

本研究首先采用了AD患者與健康的患者形成對照比較，發(fā)現(xiàn)VTRNA2-1基因表達水平在AD患者中顯著增高，進一步將AD患者按照疾病嚴重程度進行分組，結果顯示，VTRNA2-1基因表達水平隨著AD嚴重程度的加重而升高，且后續(xù)研究證實了SCORAD評分于VTRNA2-1基因表達水平存在明顯的正相關，因此初步認為VTRNA2-1在活化的分泌細胞因子的人CD4+T細胞中高度上調，其升高可能與AD疾病嚴重程度有關。VTRNA2-1基因的高表達在許多腫瘤組織中均有表現(xiàn)，其可以通過啟動二核苷酸修飾在表觀遺傳上受控制，并且可以發(fā)揮抑癌或致癌功能，且VTRNA2-1啟動子的甲基化狀態(tài)及其與臨床相關參數(shù)存在相關性[11]。不過在與細胞因子產生相關的T細胞活化過程中，VTRNA2-1是以依賴于持續(xù)刺激的方式高度上調。Sallustio等[12]在IgA腎病患者研究中發(fā)現(xiàn)高甲基化區(qū)域的VTRNA2-1參與了CD4+T細胞的應答和增殖，該區(qū)域導致CD4+的TCR信號強度降低，使得T細胞及其異常反應和激活可能解釋了T輔助細胞的不平衡。

為了評估VTRNA2-1參與AD具體機制情況，我們進行了RNA印跡分析和免疫共沉淀實驗，印跡實驗證實了VTRNA2-1蛋白在活化細胞的上調，同時還測試了最豐富的PKR蛋白表達，發(fā)現(xiàn)VTRNA2-1在VTRNA2-1表達細胞中與PKR共免疫沉淀。既往在癌細胞中已發(fā)現(xiàn)VTRNA2-1與關聯(lián)并抑制RNA依賴的PKR蛋白，在人T細胞中也如此，由于VTRNA2-1具有細胞質，可與PM1人類T細胞系中的PKR相互作用，同時VTRNA2-1可抑制人CD4+T細胞細胞系裂解物中介導的PKR活化[13,14]。VTRNA2-1的表達及其與PKR的相互作用可以作為控制PKR與各種信號通路相互作用的能力的開關，這種開關改變通路的存在，其中PKR在病程進展參與抗增殖促凋亡的作用，因此可以解釋VTRNA2-1的高表達狀態(tài)可能是激活相關PKR信號傳導的主要調節(jié)因子[15]。

綜上所述，VTRNA2-1在AD患者的CD4+T淋巴細胞中呈高表達狀態(tài)，VTRNA2-1表達升高可能加重患者臨床癥狀嚴重程度，因此VTRNA2-1可能是是T細胞介導的炎癥的標志物，其機制可能是通過人類細胞中PKR依賴性信號傳導和相關細胞因子產生的調節(jié)劑，在AD病理過程中發(fā)揮調控作用，可作為未來臨床治療靶標。