毛 山， 周 明， 王俊峰， 李 軍， 曹 政

(湖北省十堰市太和醫(yī)院心內(nèi)科, 湖北 十堰 442000)

冠心病因冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或組塞，進(jìn)而造成心肌缺氧、缺血、壞死導(dǎo)致的心臟病。隨著分子生物學(xué)和基因?qū)W研究進(jìn)展，冠心病基因機(jī)制的研究受到重視，認(rèn)為冠心病是多基因遺傳性疾病，而基因多態(tài)性是決定這種遺傳性的重要原因[1,2]。近年來發(fā)現(xiàn)，氧化酶P22pbox亞基通過調(diào)節(jié)酶活性進(jìn)而促進(jìn)NADPH氧化酶生成自由基，是自由基生成的重要環(huán)節(jié)，而第242密碼子的C-T基因突變，影響血管自由基生成，可能是誘發(fā)頸動(dòng)脈粥樣硬化的原因之一[3,4]?；诖耍瑸樘骄緾242T基因多態(tài)性在冠心病發(fā)病機(jī)制中的作用，研究選取本院118例冠心病性患者與同期96例健康者進(jìn)行對(duì)比，觀察其基因型及等位基因頻率分布情況，探尋其基因表達(dá)與冠心病的相關(guān)性，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2019年10月―2020年10月期間本院收治的118例冠心病患者作為觀察組，其中男61例，女57例，年齡39～87歲，平均年齡(64.34±5.26)歲。并選取同期的96例體檢無冠心病人群作為對(duì)照組，其中男56例，女40例，年齡39～87歲，平均年齡(63.27±5.34)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合全國腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)MRI確診為冠心病者，年齡>18歲；②臨床資料完整者；③患者及家屬同意并簽署知情通知書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、肝、腎或血液疾病者；②合并全身性慢性或免疫性疾病者；③近期出現(xiàn)顱腦損傷、創(chuàng)傷或手術(shù)者；④孕婦哺乳期婦女；⑤不配合基因多態(tài)性檢測(cè)研究者。研究獲我院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方 法

1.2.1C242T基因檢測(cè):引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用Gene Amp9300定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-PFLP)儀(ABI)進(jìn)行SNP檢測(cè)及終點(diǎn)讀序。使用常規(guī)序列引物(上游5′-TGCTT-GTGGGTAAACCAAGGCCGGTG-3′，下游5′-AA-CACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCGT-3′)，引物稀釋冷藏處理后待PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50μL，模板DNA 15 μL，引物2μL，2×PCR反應(yīng)混合物25μL，雙蒸水8μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 3min，變性 95℃ 30s，退火65℃30s，延伸72℃45s，30個(gè)循環(huán)，末次延伸72℃10min，然后待反應(yīng)管冷卻至4℃。PCR產(chǎn)物15μL，加上緩沖液3μL，放置2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，時(shí)間為30min，凝膠成像后系統(tǒng)觀察。再取PCR產(chǎn)物10μL進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系20μL，于常溫下孵育16h，取酶切產(chǎn)物15μL，加入緩沖液3μL，置于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，時(shí)間為30min，膠成像后系統(tǒng)檢測(cè)器結(jié)果，分析其基因型，確定C242T基因有TT、CT、CC基因型分布。然后對(duì)PCR產(chǎn)物采用核苷酸序列測(cè)序驗(yàn)證，確定C242T基因T、C兩種等位基因分布頻率。

1.2.2指標(biāo)檢測(cè):搜集兩組研究對(duì)象性別、年齡、BMI、血壓史、糖尿病史吸煙史，進(jìn)行甘油三酯(triglyceride，TG)、同型半胱氨酸(homocysteinemia，HCY)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)、超敏C反應(yīng)蛋白((high sensitivity C reactive protein，Hs-CRP)、腦鈉尿肽(Brain natriuretic peptide，BNP)、脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，LP(a)]、白細(xì)胞(white blood cell，WBC)等指標(biāo)水平檢測(cè)，使用貝克曼庫爾特 AU680 全自動(dòng)生化分析儀完成檢測(cè)，并進(jìn)行對(duì)比分析。

1.3觀察指標(biāo):根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)兩組研究對(duì)象C242T基因中TT型、CT型、CT型及T、C兩種等位基因頻率的分布情況。

2 結(jié) 果

2.1一般資料比較:兩組一般資料比較，性別、年齡、BMI、吸煙史、LDL-C等資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而觀察組高血壓史、糖尿病史發(fā)生率高于對(duì)照組，且TG、TC、HDL-C、Hs-CRP、BNP、HCY、LP(a)、WBC等指標(biāo)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2C242T基因在兩組中基因型和等位基因頻率分布情況比較:兩組基因分布符合哈代-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡(F值分別為0.527和0.715，P>0.05)，因此，兩組基因型分布頻率達(dá)到基因遺傳平衡標(biāo)準(zhǔn)，可提現(xiàn)人群基因分布情況，樣本具有代表性。且觀察組C242T基因中TT型、CT型基因頻率和T等位基因頻率分布均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 C242T基因基因型和等位基因頻率分布情況比較n(%)

2.3冠心病患者不同基因型攜帶者血脂指標(biāo)水平比較:TT+CT型基因攜帶患者HDL-C水平顯著低于CC型基因攜帶患者(P<0.05)，而不同基因型患者間其他血脂指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 冠心病患者不同基因型攜帶者血脂指標(biāo)水平比較

2.4冠心病危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析:對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的相關(guān)因素進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病(OR=1.422，95%CI：1.164～1.737)、HDL-C(OR=1.534，95%CI：1.011～2.329)、HCY(OR=1.241，95%CI：1.159～1.329)、攜帶T型基因(OR=1.265，95%CI：1.151～1.390)是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 冠心病影響因素的Logistic回歸分析

3 討 論

NADPH氧化酶是一種廣泛分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等氧化酶復(fù)合體，C242T基因多態(tài)性可通過各種細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起氧化還原基因表達(dá)，參與血管壁細(xì)胞引起的各種病理過程，可促使血管平滑肌細(xì)胞增生，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞舒縮功能，刺激炎性反應(yīng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[5]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C242T基因在冠心病發(fā)生中具有重要聯(lián)系，冠心病患者C242T基因中T型攜帶者比例更高。因此，對(duì)冠心病患者進(jìn)行基因檢測(cè)，可為臨床診斷及基因調(diào)節(jié)治療提供重要依據(jù)。

研究通過兩組研究對(duì)象C242T基因型分布頻率發(fā)現(xiàn)，觀察組C242T基因中T基因型和T型等位基因分布頻率顯著高于對(duì)照組，說明C242T基因中TT基因型和T型等位基因攜帶者與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)，T型基因攜患者HDL-C水平顯著高于C型基因攜帶者，提示C242T基因中T基因型攜帶者對(duì)冠心病的發(fā)生具有一定促進(jìn)作用，這與國內(nèi)外的相關(guān)研究中基因多態(tài)性在冠心病中具有重要意義的報(bào)道具有一致性[6]。究其原因，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶p22phox亞基C242T基因中C242T基因多態(tài)性可取代氨酸被酪氨酸，改變NADPH氧化酶活性，進(jìn)而增加活性氧含量，進(jìn)而改變血管系統(tǒng)中活性氧氧化還原狀態(tài)，并導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)低密度脂蛋白氧化，進(jìn)而加速動(dòng)脈粥樣斑塊形成[7]。由此可知，C242T基因可通過影響血管中活性氧誘導(dǎo)內(nèi)皮炎性反應(yīng)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增生，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。提示我們可通過對(duì)冠心病患者和健康者進(jìn)行基因分型比較，分析等位基因頻率或者基因型在兩組人群中分布的差異，從而確定基因多態(tài)性是否與冠心病的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)臨床診斷及治療提供指導(dǎo)依據(jù)[8]。

另外，對(duì)冠心病危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，合并糖尿病、HDL-C高于正常水平、HCY高于正常水平、攜帶T型基因是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說明C242T基因多態(tài)性參與冠心病的發(fā)生，T型基因攜帶者冠心病患病率較高。究其原因，糖尿病患者因高糖狀態(tài)，機(jī)體處于免疫缺陷狀態(tài)，易導(dǎo)致脂質(zhì)在血管壁累積，進(jìn)而增加血管病變風(fēng)險(xiǎn)，而成為影響動(dòng)脈粥樣硬化的影響因素之一[9]。HDL-C水平過低，抑制LDL-C氧化修飾作用降低，導(dǎo)致脂質(zhì)進(jìn)入血管壁內(nèi)，而在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊上沉積，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[10]。HCY過高會(huì)促進(jìn)超氧化酶及過氧化物產(chǎn)生，進(jìn)而損失血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，導(dǎo)致血管平滑肌收縮、缺氧，參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[11]。C242T基因T多態(tài)性可通過增加活性氧含量，氧化修飾脂蛋白，進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及進(jìn)展，這與國外的相關(guān)中C242T基因多態(tài)性與高血壓、腦梗死、頸動(dòng)脈粥樣硬化等疾病有關(guān)的報(bào)道一致[12]。但是，研究中樣本對(duì)象較少，加上基因表達(dá)的個(gè)體差異，且C242T基因只是冠心病研究的一小部分，且遺傳機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)基因。因此，還需擴(kuò)大樣本進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步探究基因多態(tài)性在冠心病發(fā)生機(jī)制的意義，了解疾病的遺傳基礎(chǔ)有助于探索新的疾病通路，發(fā)展疾病診斷和治療的新手段，為臨床治療提供新方向。

綜上所述，C242T基因T型攜帶者更易發(fā)生冠心病，可通過檢測(cè)其基因，深入了解其基因型和等位基因頻率的分布和表達(dá)情況，找到冠心病發(fā)生的內(nèi)在因素，進(jìn)而為早期診斷和防治提供了指導(dǎo)。