李冰玉 溫海深 王靈鈺 李金庫 齊 鑫 李 昀

花鱸性腺分化組織學及性別相關(guān)基因和的表達分析*

李冰玉 溫海深 王靈鈺 李金庫 齊 鑫 李 昀①

(中國海洋大學 海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室 山東 青島 266003)

以花鱸() 1～214 dph (day post hatching)的仔稚魚、幼魚以及18月齡的雌魚和雄魚為研究對象，研究了花鱸早期性腺發(fā)生、發(fā)育和分化情況；分析了性腺分化過程中性別相關(guān)基因(和)的表達及與性別之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在30 dph [全長為(1.28± 0.10) cm]，首次在中腎管前端的腹腔膜周圍觀察到原始生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)，說明30 dph前是花鱸胚后PGCs遷移至生殖嵴的關(guān)鍵時期；在55 dph [全長為(2.45±0.19) cm]，觀察到一對呈對稱分布的原始性腺已經(jīng)形成，說明花鱸幼魚的原始性腺在30～55 dph (全長為1.28～2.45 cm)之間發(fā)生；55～180 dph時(全長為2.45～12.28 cm)，原始性腺不斷發(fā)育變大，并且一直處于未分化狀態(tài)；180 dph后性腺開始分化；在195 dph [全長(14.54±1.54) cm]觀察到精巢開始分化，卵巢于205 dph [全長為(15.86±0.94) cm]開始分化，且性腺的解剖學分化要早于細胞學分化；18月齡的花鱸幼魚性腺發(fā)育到Ⅱ期。性別分化相關(guān)基因在花鱸卵巢中的表達量高于同期精巢，說明其在卵巢的分化及維持中發(fā)揮更關(guān)鍵的作用，而在18月齡幼魚Ⅱ期精巢中的表達量顯著高于同時期的卵巢及Ⅰ期精巢，說明其主要在精巢的分化及維持中扮演重要角色。本研究結(jié)果不僅可以豐富花鱸的繁殖生理學資料，也為其性別調(diào)控技術(shù)的研究提供了科學依據(jù)。

花鱸；性別分化；組織學；；

原始生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)作為魚類生殖細胞系的祖先，在胚胎發(fā)育的早期階段從體細胞中分化出來(宋卉等, 2004)。在組織學上，PGCs呈現(xiàn)體積大、圓形或橢圓形、具有一個大且明亮的圓形細胞核、細胞質(zhì)為嗜酸性等生物學特征(游秀容, 2012)。在胚胎發(fā)育過程中，PGCs按照特定的遷移路線到達生殖嵴的位置，與周圍體細胞共同發(fā)育形成原始性腺，即未分化的性腺。在硬骨魚類中，雌雄異體型是最常見的性腺分化類型，具有雙向分化潛力的未分化性腺直接發(fā)育為卵巢或精巢，此后性別保持終身不變(楊陽, 2018)。

魚類作為低等脊椎動物，具有多種性別決定方式，主要為基因型性別決定、環(huán)境型性別決定和基因–環(huán)境相互作用型性別決定(Strüssmann, 2002)。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，魚類性別決定基因或相關(guān)基因也被不斷鑒定，主要有、、、以及芳香化酶基因等(李云航等, 2011; 路暢等, 2014; 文愛韻等, 2008)。性別相關(guān)基因又可進一步分為精巢分化相關(guān)基因和卵巢分化相關(guān)基因。其中，性腺芳香化酶基因通常在卵巢分化過程中呈高表達，因為編碼的性腺芳香化酶可將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，從而促進卵巢分化(Kishida, 2001; Kobayashi, 2010; Tang, 2010; Si, 2016)。而其旁系同源基因則屬于精巢分化相關(guān)基因，編碼的11β-羥化酶可促進雄激素的合成，從而阻礙卵巢的分化，導致精巢分化(Blázquez, 2009; Driscoll, 2020)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2019年10—11月在山東省東營市利津縣雙瀛水產(chǎn)苗種有限責任公司，對來自黃渤海的花鱸親魚群體進行人工催產(chǎn)及人工授精，獲取同批次受精卵，受精卵孵化后的花鱸仔稚魚培育參考溫海深等(2019)的方法進行。培養(yǎng)條件：水溫為15℃～20℃，鹽度為28～30，pH為7.5～8.0，溶解氧>5.0 mg/L，總氨氮<1.0 mg/L。

1.2 樣品采集

自初孵仔魚開始，每隔10 d左右取樣1次，每次隨機選取20尾魚。取樣時，先用適量MS-222 (200 mg/L)麻醉，測量全長及體長。當全長<2 cm時，全魚固定于波恩氏液中；當全長為2～10 cm時，取含性腺的軀干部分固定；當全長>10 cm，性腺可以單獨剝離時，取其中一部分性腺用波恩氏液固定，另一部分置于液氮中快速冷凍，?80℃保存，用于RNA提取。

1.3 石蠟組織切片

含性腺的組織經(jīng)波恩氏液固定24 h后，經(jīng)70%～ 100%梯度乙醇脫水(70%乙醇40 min，80%乙醇40 min，95%乙醇35 min×2，100%乙醇25 min×2)，二甲苯透明(1/2乙醇＋1/2二甲苯混合液15 min，二甲苯15 min×2)，浸蠟(石蠟20 min×3)，石蠟包埋，然后連續(xù)切片為5～ 7 μm的組織片，經(jīng)蘇木精–伊紅(HE)染色，中性樹脂封片后鏡檢觀察。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

使用Trizol法提取性腺總RNA，并利用核酸測定儀(OSTC, 中國)檢測提取后的OD值及RNA濃度。同時進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性。將RNA濃度調(diào)至500 ng/μL，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)] (諾唯贊, 中國)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系和反應條件：(1)去除基因組DNA：總RNA 1 μL，4× gDNA wiper Mix 4 μL, RNase-free ddH2O加至16 μL，在42℃反應2 min；(2)反轉(zhuǎn)錄：上述反應產(chǎn)物16 μL，5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix 4 μL，37℃反應15 min后，85℃反應5 s。

1.5 實時熒光定量PCR

(MN685653)和(MN685656)基因序列來源于NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物，并由華大基因Oligo合成，所用引物序列見表1。使用ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix (High ROX Premixed)試劑盒(諾唯贊, 中國)，StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, 美國)進行實時熒光定量PCR (RT-qPCR)，20 μL反應體系：2 μL cDNA，10 μL ChamQTMSYBR Color qPCR Master Mix，上下游引物各0.4 μL，7.2 μL ddH2O。qPCR擴增反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。RT-qPCR實驗均包括4個生物學重復和3個技術(shù)學重復。以18S作為花鱸內(nèi)參基因(Wang, 2018)，使用2?ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)計算，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，當<0.05時為差異顯著。

表1 qPCR特異性引物

2 結(jié)果

2.1 花鱸性腺形成及分化

取樣期間，隨著天數(shù)的增加，花鱸全長呈平穩(wěn)增長趨勢。在180 dph (days post hatching)，花鱸平均全長為(12.28±1.30) cm，此前性腺處于未分化狀態(tài)，自此性腺開始出現(xiàn)組織學分化(圖1)。

圖1 花鱸全長與孵化后天數(shù)之間的關(guān)系

2.1.1 原始性腺的形成和未分化性腺的發(fā)育 30 dph，仔魚平均全長為(1.28±0.10) cm。如圖2A所示，PGCs遷移到中腎管前端的腹腔膜周圍。PGCs呈圓形或橢圓形，直徑處于(6.48～7.26) μm之間，具有一個大且明亮的圓形細胞核，被蘇木精濃染成紫色，而細胞質(zhì)呈嗜弱酸性，著色較淺。

圖2 花鱸原始性腺和未分化性腺的發(fā)育

55 dph，稚魚平均全長為(2.45±0.19) cm。此時觀察到PGCs已遷入生殖嵴中，并且一對原始性腺已經(jīng)形成，呈對稱分布，從腹腔后側(cè)的腸系膜出發(fā)向前延伸。原始生殖細胞在原始性腺中排列較稀疏，周圍有豐富的結(jié)締組織(圖2B)。

80 dph，幼魚平均全長為(4.33±0.34) cm。牽引性腺一端的系膜變長，另一端持續(xù)向腹部延伸，體積明顯增大，呈梨形，其中生殖細胞數(shù)量顯著增加(圖2C)。

125 dph，幼魚平均全長為(6.83±0.49) cm。性腺繼續(xù)生長，橫切面平均長度為(100.45±9.20) μm，寬度為(38.90±4.15) μm (圖2D)。

180 dph，幼魚平均全長為(12.28±1.30) cm，原始性腺橫切面平均長度增長至(187.36±19.18) μm，寬度為(49.02±4.32) μm (圖2E)。此時伴隨著有絲分裂的不斷進行，性原細胞逐漸被體細胞包繞形成生殖細胞囊，散布在整個性腺中。

2.1.2 精巢和卵巢的早期分化 195 dph，花鱸幼魚平均全長為(14.54±1.54) cm，在靠近背部的區(qū)域出現(xiàn)裂縫狀的輸精管，表明在解剖學上精巢已經(jīng)開始分化，此時為Ⅰ期精巢。Ⅰ期精巢的橫切面為三角形，通過系膜與鰾組織相連，并且周圍結(jié)締組織豐富；在靠近腹部的邊緣區(qū)域觀察到數(shù)個精原細胞(圖3A)。當精巢發(fā)育至205 dph時，靠近腹部的區(qū)域已被隔膜分割成很多小葉狀結(jié)構(gòu)，但排列較稀松(圖3B)。215 dph，精巢繼續(xù)發(fā)育，伴隨著精原細胞強烈的有絲分裂，精小葉的排列變得緊密，形狀不規(guī)則。精小葉由一圈精原細胞囊構(gòu)成，每個生殖細胞囊周圍都由1個或多個著色很深的sertoli前體細胞圍繞；精小葉中間形成一個空腔即小葉腔，待精子成熟后可將其排出體外。精原細胞呈圓形或橢圓形，細胞核大而圓，占整個胞體體積的4/5，并且有一個著色很深的核仁，相反細胞質(zhì)不易著色(圖3C)。

205 dph，花鱸幼魚平均全長為(15.86±0.94) cm。如圖3D～E所示，此時在性腺中部出現(xiàn)一條較整齊的細長條裂縫，將來發(fā)育為卵巢腔，這標志著組織學上卵巢的分化。Ⅰ期卵巢的橫切面呈彎曲的梨形，靠近背部豐富的結(jié)締組織和血管組織，卵原細胞分散的排列在性腺中。此時，僅憑大小和形態(tài)上的區(qū)別不能將卵原細胞和精原細胞區(qū)分開。

215 dph，幼魚平均全長為(17.20±1.28) cm。在卵巢中，隨著性腺的分化，卵巢腔逐漸向外圍延伸形成完整的腔體結(jié)構(gòu)，此時產(chǎn)卵板開始形成，逐漸向卵巢腔內(nèi)延伸，產(chǎn)卵板外側(cè)分布著卵原細胞。卵原細胞形態(tài)同精原細胞一樣呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)較少，著色淺，大而圓的細胞核呈嗜堿性著色較深(圖3F)。

圖3 花鱸精巢和卵巢的早期分化

2.2 18月齡花鱸幼魚Ⅱ期精巢和卵巢的發(fā)育

18月齡花鱸幼魚性腺發(fā)育到Ⅱ期。Ⅱ期精巢在解剖鏡下觀察到與Ⅰ期精巢組織結(jié)構(gòu)相似，但血管組織增多。此階段管腔內(nèi)的生殖細胞主要包括精原細胞和初級精母細胞，與精原細胞相比，初級精母細胞體積明顯縮小，但細胞核的嗜堿性增強(圖4A～B)。

Ⅱ期卵巢與Ⅰ期卵巢相比，產(chǎn)卵板變寬變長，呈大小不一的細長板狀緊密排列在卵巢腔四周。此階段仍有少量的卵原細胞，但大部分已停止有絲分裂，進入初級卵母細胞的小生長期階段，此時的卵母細胞體積明顯大于卵原細胞，核膜清晰，胞質(zhì)增多且呈強嗜堿性，被染成深紫色，而細胞核則不易被染色，但核內(nèi)有數(shù)個染成藍紫色的核仁(圖4C～D)。

圖4 花鱸Ⅱ期精巢和卵巢

2.3 cyp11b和cyp19a1a基因的表達

利用RT-qPCR技術(shù)測定了花鱸芳香化酶基因和在性別分化初期幼魚Ⅰ期精巢和卵巢以及18月齡幼魚Ⅱ期精巢和卵巢中的相對表達水平，結(jié)果如圖5所示。

在性別分化初期幼魚的Ⅰ期性腺中，在精巢中的表達量顯著高于卵巢。隨著性腺的發(fā)育，在18月齡幼魚Ⅱ期精巢中，的表達量顯著高于同時期的卵巢及Ⅰ期精巢(圖5A)。相反，在性別分化初期幼魚的Ⅰ期卵巢中的表達量顯著高于同時期精巢，在Ⅱ期卵巢中的表達量高于同時期的精巢，但明顯低于Ⅰ期卵巢(圖5B)。

3 討論

3.1 性腺的發(fā)生及分化

PGCs作為魚類生殖細胞系的祖先，在胚胎發(fā)育的早期階段就已經(jīng)形成(宋卉等, 2004)，然后按照特定的遷移路線到達生殖嵴的位置，與周圍體細胞共同發(fā)育形成原始性腺。在不同魚類中，原始性腺發(fā)生的時間各不相同。紅鰭東方鲀()于12 dph觀察到一對原始性腺的形成(胡鵬等, 2015)；大黃魚()于20 dph觀察到由系膜懸掛在腹膜上皮上的原始性腺(游秀容, 2012)；牙鲆()的原始性腺于22 dph形成于腎臟腹腔后方(楊陽, 2018)；許氏平鲉()的原始性腺于25 dpb (day post birth)起逐漸發(fā)育(王孝杰等, 2019)。在花鱸中，30 dph首次在性腺原基區(qū)域觀察到PGCs的出現(xiàn)，55 dph觀察到線形原始性腺已經(jīng)形成，因此，推測30 dph前是花鱸胚后PGCs遷移至生殖嵴的關(guān)鍵時期，原始性腺發(fā)生在30～55 dph之間。

圖5 cyp11b和cyp19a1a在性別分化初期(Ⅰ期)及Ⅱ期精巢和卵巢中的相對表達水平

在硬骨魚類中，雌雄異體型是最常見的性腺分化類型，大多數(shù)雌雄異體的魚類未分化性腺將直接分化為卵巢或精巢(Devlin, 2002)。魚類的性腺分化包括解剖學分化和細胞學分化2個方面，解剖學分化是指卵巢腔、輸精管和血管的形成等組織形態(tài)的變化，細胞學分化的標志為生殖細胞開始進入減數(shù)分裂(宋卉等, 2004)。一般解剖學分化早于細胞學分化 (黨廣成等, 2011; 楊陽, 2018)。不同魚類的性腺分化時間存在較大差異，即使是同一物種，雌性和雄性的性腺分化時間也不同。在許氏平鲉中，35 dpb時卵巢腔開始形成，68 dpb時輸精管開始形成(王孝杰等, 2019)。大黃魚卵巢的解剖學分化開始于55日齡，精巢的解剖學分化開始于95日齡(游秀容, 2012)。在圓斑星鰈()中，60日齡的雌魚性腺開始出現(xiàn)卵巢腔，而同時期的雄魚沒有明顯的性腺分化特征(楊珍珍等, 2020; 張樂樂, 2018)。在斑石鯛()中，120日齡觀察到輸精管原基的出現(xiàn)，150日齡觀察到卵巢腔的出現(xiàn)(趙玉柱等, 2020)?；|幼魚在180 dph時，性腺還處于未分化狀態(tài)(圖2E)，隨后在195 dph時觀察到輸精管的出現(xiàn)，表明精巢在解剖學上開始分化，于207 dph觀察到卵巢腔的形成，表明卵巢解剖學分化已經(jīng)開始，在此階段雌雄性腺均未出現(xiàn)細胞學分化的標志。這說明與大多數(shù)魚類一樣(楊陽, 2018; 游秀容, 2012; 張樂樂, 2018)，花鱸性腺的解剖學分化要早于細胞學分化。

3.2 cyp11b和cyp19a1a在精巢和卵巢中的表達

在魚類性別決定和分化過程中，性類固醇激素發(fā)揮重要作用。芳香化酶基因?qū)儆诩毎豍450超家族的成員，這種復合酶可將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，而雌激素是促進卵巢分化的重要因子(Simpson, 2002)。在魚類中，存在性腺芳香化酶和腦芳香化酶 2種類型，分別由和編碼(Kishida, 2001)?；蛟诩棺祫游镏幸愿叨缺Ｊ氐姆绞皆谛詣e決定的早期表現(xiàn)出性別二態(tài)性，在雌性性腺中呈現(xiàn)高表達，這使得該基因成為性別決定和卵巢分化的關(guān)鍵因子(王金等, 2014; Driscoll, 2020)。在尼羅羅非魚() (Ijiri, 2008)、齊口裂腹魚() (Yan, 2019)、茅耙麗魚() (Driscoll, 2020)等多種魚類卵巢中的表達量顯著高于精巢，都表明其在卵巢發(fā)育中發(fā)揮更重要作用，而其在精巢中也存在低表達，是因為通過芳構(gòu)化產(chǎn)生的低水平雌激素對精子形成是必要的(Schulz, 2010)。細胞色素P450家族的另一個成員11β-羥化酶基因()是催化11-酮基睪酮(11-KT)合成所必需的，而11-KT是硬骨魚類內(nèi)源性的雄激素，對阻礙卵巢分化并導致精巢的分化及維持有重要作用(王婷茹, 2013; Driscoll, 2020)。在尼羅羅非魚(Ijiri, 2008; 康愷等, 2020)、虹鱒() (Vizziano, 2007)、日本鰻鱺() (Jianga, 1996)等多種硬骨魚的精巢分化早期階段都被檢測到高表達。更重要的是，在與花鱸進化關(guān)系很近的歐洲鱸中，和的表達差異可在組織學水平性別分化跡象前1個月檢測到，它們分別與未來的雌雄表型有明顯的相關(guān)性，因此，它們可作為組織學上未分化歐洲鱸表型性別預測的早期分子標記(Blázquez, 2009)。本研究表明，在花鱸性別分化初期(Ⅰ期)以及性腺發(fā)育到Ⅱ期的雌魚和雄魚中，在Ⅰ期和Ⅱ期精巢中的表達都顯著高于卵巢，相反，在Ⅰ期和Ⅱ期卵巢中的表達都顯著高于精巢，與在其他硬骨魚中的表達趨勢一致。結(jié)果說明，在性腺分化及維持期間，在精巢中扮演更重要的角色，而主要是在卵巢中發(fā)揮作用。由于目前在花鱸中尚缺乏性別相關(guān)的遺傳分子標記，所以不能確定在組織學上的性別分化標志出現(xiàn)之前，和的表達趨勢是否可以預測未來卵巢和精巢的分化。但是，根據(jù)歐洲鱸的研究結(jié)論，結(jié)合本研究結(jié)果，有理由推測，在花鱸性腺分化的第1個組織學特征明顯之前，和在性腺中的差異表達或許可能成為預測未來分化成卵巢和精巢的分子依據(jù)。

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Histology of Gonadal Differentiation and Expression Analysis of Sex-Related Genes,in Spotted Sea Bass ()

LI Bingyu, WEN Haishen, WANG Lingyu, LI Jinku, QI Xin, LI Yun①

(Ocean University of China, Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Qingdao, Shandong 266003,China)

The gonadogenesis, the development and differentiation of larvae and juveniles from 1～214 days post hatching (dph) and 18-month-old female and male spotted sea bass () were studied. The relationship between the expression of sex-related genes (and) and sex in the process of gonadal differentiation was discussed. The results showed that at 30 dph [(1.28±0.10) cm], primordial germ cells (PGCs) were first observed around the peritoneal membrane at the front end of the mesorenic duct, indicating that the time before 30 dph was the critical period for PGCs to migrate to the genital ridge. At 55 dph [(2.45±0.19) cm], a pair of symmetrically distributed primitive gonads was observed, indicating that the primitive gonads of the juvenile spotted sea bass were formed between 30 and 55 dph [(1.28～2.45) cm]. Between 55～180 dph [(2.45～12.28) cm], the primordial gonads continued to grow and remained in an undifferentiated state. After 180 dph, the gonads began to differentiate; at 195 dph [(14.54±1.54) cm], we observed that the testis began to differentiate, while the ovary began to differentiate at 205 dph [(15.86±0.94) cm]. The anatomical differentiation of the gonads was earlier than the cytological differentiation in spotted sea bass. The gonad of 18-month-old spotted sea bass developed to stageⅡ. The expression level of the sex differentiation-related genein the ovary of spotted sea bass was higher than that of the contemporaneous testis, indicating that it played a key role in the differentiation and maintenance of the ovary. The expression level ofat stageⅡ testis of 18-month-old juveniles was significantly higher than in the contemporaneous ovary and stage Ⅰ testes, suggesting that it played a crucial part in the differentiation and maintenance of testes. The results not only enriched our understanding of the reproductive physiology of spotted sea bass, but also provided a scientific basis for the study of sex selection technology.

; Gonad differentiation; Histology;;

LI Yun, E-mail: yunli0116@ouc.edu.cn

S917.4

A

2095-9869(2021)06-0185-09

10.19663/j.issn2095-9869.20201215001

http://www.yykxjz.cn/

李冰玉, 溫海深, 王靈鈺, 李金庫, 齊鑫, 李昀. 花鱸性腺分化組織學及性別相關(guān)基因和的表達分析. 漁業(yè)科學進展, 2021, 42(6): 185–193

LI B Y, WEN H S, WANG L Y, LI J K, QI X, LI Y. Histology of gonadal differentiation and expression analysis of sex-related genesandin spotted sea bass (). Progress in Fishery Sciences, 2021, 42(6): 185–193

李 昀，副教授，E-mail: yunli0116@ouc.edu.cn

2020-12-15,

2021-01-08

*財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助 [This work was supported by China Agriculture Research System of MOF and MARA].李冰玉，E-mail: 1032566031@qq.com

(編輯 馬璀艷)