羅 璋 陳紅蓮 張振國 郝 爽 韓進(jìn)剛 孫少起 馮守明

枯草芽孢桿菌表達(dá)柱狀黃桿菌基因口服疫苗對草魚免疫保護(hù)效果的研究*

羅 璋1,2陳紅蓮1張振國3郝 爽2韓進(jìn)剛3孫少起4馮守明3①

(1. 水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點實驗室 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所 安徽 合肥 230031； 2. 天津市水產(chǎn)研究所 天津 300221；3. 天津市動物疫病預(yù)防控制中心 天津 300221； 4. 天津市凱潤淡水養(yǎng)殖有限公司 天津 300221)

枯草芽孢桿菌()是一種水產(chǎn)益生菌，最近也被用作口服疫苗的投遞載體。本研究利用前期篩選到的柱狀黃桿菌()保護(hù)性抗原基因，與pBE2R載體連接后，以質(zhì)粒的方式轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800中，構(gòu)建了重組菌株WB800 (pBE2R-lip)。聚丙酰胺電泳和免疫印跡實驗表明，枯草芽孢桿菌WB800 (pBE2R-lip)能表達(dá)lip蛋白，其分子量約為32 kDa。利用枯草芽孢桿菌WB800 (pBE2R-lip)口服免疫草魚()后，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗，在受免草魚血清中檢測到特異性抗體效價的上升，在人工感染實驗中，受免草魚的免疫保護(hù)率為52.4%。本研究表明，利用枯草芽孢桿菌能有效表達(dá)柱狀黃桿菌的基因，以其作為口服疫苗能引起草魚的免疫應(yīng)答并提供免疫保護(hù)效果。

柱狀黃桿菌；枯草芽孢桿菌；草魚；口服疫苗

口服疫苗具有使用方便、應(yīng)激性小、不受魚體大小限制等優(yōu)點，但由于其免疫效果不佳而在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中很少被使用(Adelmann, 2008; Vandenberg, 2004)?？乖妆幌乐械奈杆岷拖钙茐谋徽J(rèn)為是影響其免疫保護(hù)效果的主要原因之一(Ellis, 1998)。為了解決該問題，通常使用海藻酸鹽和乙基纖維素等基質(zhì)將疫苗包被，幫助抗原抵抗胃和前腸的不良環(huán)境，使其順利到達(dá)中腸和后腸，從而被免疫細(xì)胞吸收、分解和呈遞，激發(fā)免疫應(yīng)答(Vervarcke, 2002; Joosten, 1997; Romalde, 2004)。這種方式雖然能有效減少胃酸和消化酶對抗原的破壞，但同時也會因基質(zhì)的存在阻礙抗原的吸收，從而影響免疫效果(Lillehaug, 1989)。此外，相對于哺乳動物而言，魚類中腸和后腸較短，導(dǎo)致食物在腸道中存留時間短，給口服疫苗制備工藝帶來挑戰(zhàn)。

酵母菌、芽孢桿菌是水產(chǎn)動物常用的益生菌 (樊英等, 2021; 楊運楷等, 2020)。近年來，利用這些微生物作為載體表達(dá)病原的保護(hù)性抗原基因及制備魚類口服疫苗的方法引起研究人員的關(guān)注。Liu等(2020)利用酵母菌表達(dá)皰疹病毒(Cyprinid herpesvirus 3)基因，制備成口服疫苗，能使抗原順利到達(dá)中腸，并給建鯉(var. Jian)提供53.33%～66.67%的免疫保護(hù)率。耿小雪等(2016)利用畢赤酵母()成功表達(dá)了白斑病毒綜合征病毒VP28和VP26蛋白，為疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。利用枯草芽孢桿菌()呈遞白斑綜合征病毒VP28蛋白時發(fā)現(xiàn)，通過拌料投喂能使VP28蛋白順利到達(dá)凡納濱對蝦()的中腸和肝胰腺，并激活對蝦的先天性免疫系統(tǒng)，免疫保護(hù)率為80.06% (Fu, 2011; 沈文英等, 2012)，比利用基因制備的核酸疫苗具有更高的免疫保護(hù)率(張敬艷等, 2012)。Jiang等(2019)利用枯草芽孢桿菌表達(dá)草魚呼腸孤病毒VP4蛋白制備成口服疫苗，受免草魚()的腸道和血清中特異性抗體都有顯著提升，并具有47%的免疫保護(hù)效果。Yao等(2019)利用枯草芽孢桿菌表達(dá)了無乳鏈球菌()的Sip蛋白，制備成口服疫苗，發(fā)現(xiàn)該疫苗能同時引起羅非魚()的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答，并提供41.7%的免疫保護(hù)效果。

柱狀黃桿菌()是魚類細(xì)菌性爛鰓病的病原，該菌宿主范圍廣泛，可以感染大部分的淡水魚(DeClercq, 2013)。在前期研究中，我們篩選到柱狀黃桿菌的保護(hù)性抗原基因，其原核表達(dá)蛋白能激發(fā)草魚的免疫應(yīng)答，并提供64%的免疫保護(hù)效果(Luo, 2016)。本研究利用枯草芽孢桿菌為載體表達(dá)基因，制備成口服疫苗免疫草魚，測定其免疫保護(hù)效果，旨在為魚類細(xì)菌性爛鰓病的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、抗體和實驗魚

柱狀黃桿菌G4株由中國科學(xué)院水生生物研究所聶品研究員饋贈。pBE2R質(zhì)粒和枯草芽孢桿菌WB800菌株由本實驗室保存。兔抗柱狀黃桿菌lip蛋白多克隆抗體委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備。利用Optimum AntigenTM軟件，預(yù)測柱狀黃桿菌lip蛋白的抗原位點，選擇抗原性較強的肽段CIDLDLNKIKKNLKA進(jìn)行合成，與偶聯(lián)載體蛋白(血藍(lán)蛋白KLH)連接后對新西蘭兔進(jìn)行免疫，2周后重復(fù)免疫1次。免疫后的第8周采血，ELISA方法檢測抗體效價，達(dá)到1∶51200。帶HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Thermo Fisher Scientific公司。實驗用草魚體長為(10.21±1.13) cm，由天津市金鎖淡水魚養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供，無發(fā)病史，實驗前參照Darwish等(2004)的方法進(jìn)行柱狀黃桿菌檢測，結(jié)果為陰性。

1.2 載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的登錄號(gi36590181)，查找柱狀黃桿菌基因的核酸序列，根據(jù)芽孢桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因，并在序列兩端分別加上Ⅰ和Ⅰ酶切位點。用T4連接酶將雙酶切后的基因片段和雙酶切后的pBE2R載體進(jìn)行連接后，以質(zhì)粒形式轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800感受態(tài)細(xì)胞(Xue, 1999)，用PCR方法進(jìn)行檢測，并獲得陽性克隆株WB800 (pBE2R-lip)。將WB800 (pBE2R-lip)接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液，28℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后，6000×g、10 min離心收集細(xì)菌，使用質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取質(zhì)粒，用Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序驗證。

1.3 SDS-PAGE和West-blotting檢測

將菌株WB800 (pBE2R-lip)按照1∶100的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(2.5%酵母粉，1.5%蛋白胨，0.3% K2HPO4，1%葡萄糖)，28℃ 150 r/min培養(yǎng)，分別在24 h和48 h取樣。6000×g離心30 min后，取上清液，用超濾管濃縮20倍，為分泌蛋白樣品。菌體用等體積PBS重懸，冰上超聲破碎10 min后，12,000×g離心30 min，取上清液，用超濾管濃縮20倍，為胞漿蛋白樣品。將不含基因的菌株WB800 (pBE2R)設(shè)為對照，通過SDS-PAGE電泳比較外泌蛋白和胞漿蛋白的組成。

將24 h和48 h的分泌蛋白和菌體蛋白SDS- PAGE電泳后，80 V電壓轉(zhuǎn)膜45 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，依次用PBST溶液漂洗3次，每次5 min。用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉l h后，加入一抗(兔抗lip蛋白多克隆抗體，1∶1000倍稀釋)室溫孵育l h，PBST洗膜3次，每次5 min。加入二抗(帶HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，1∶5000倍稀釋)室溫孵育l h，用PBST洗膜3次，每次5 min，最后顯色。

1.4 芽孢生成率的測定

用發(fā)酵培養(yǎng)基對WB800 (pBE2R-lip)進(jìn)行28℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后，用平板計數(shù)法計算菌液中細(xì)菌活體的數(shù)量。此外，取1 mL菌液于80℃水浴加熱10 min，殺死營養(yǎng)體細(xì)胞后，采用平板計數(shù)法計算菌液中芽孢的數(shù)量。芽孢生成率計算公式如下：

芽孢生成率=(芽孢的數(shù)量/活菌的數(shù)量)×100%

1.5 口服疫苗的制備

用發(fā)酵培養(yǎng)基對WB800 (pBE2R-lip)進(jìn)行28℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后，6000×g離心10 min，收集細(xì)菌，用PBS重懸后均勻噴灑在配合飼料表面，以3.0×108CFU/g飼料的比例制備成口服疫苗，陰干后，4℃保存?zhèn)溆?。同時，培養(yǎng)WB800 (pBE2R)菌株，以相同濃度添加到飼料中，作為對照組。

1.6 草魚腸道內(nèi)芽孢桿菌數(shù)量的測定

60尾健康草魚隨機平均分為2組，實驗組投喂含口服疫苗的飼料，對照組投喂普通飼料，連續(xù)投喂7 d后，2組均投喂普通飼料。按照2%體重進(jìn)行投喂，每天08:00和16:00各投喂1次。實驗魚在25℃的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖，有效水體60 L，24 h不間斷充氣，保持溶解氧>5.0 mg/L。結(jié)束投喂口服疫苗后，每天每組隨機挑選3尾魚，參照吳正存等(2011)的方法，測定草魚后腸內(nèi)容物中芽孢的數(shù)量。取腸道內(nèi)容物1 g，加入1 mL無菌PBS后，在振蕩器上充分混勻。80℃水浴處理20 min，10倍梯度稀釋后，涂布于含終濃度為30 μg/mL卡那霉素的DSM瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后，記錄芽孢數(shù)。

1.7 草魚的免疫

270尾健康草魚隨機平均分為3組，每組3個重復(fù)，暫養(yǎng)14 d以后進(jìn)行實驗，暫養(yǎng)期間的養(yǎng)殖條件和投喂方法同1.6。實驗Ⅰ組為免疫組，用口服疫苗連續(xù)投喂草魚7 d后，間隔7 d，再加強免疫1次。實驗Ⅱ組為對照組，投喂含WB800 (pBE2R)的飼料，投喂方法同實驗Ⅰ組；實驗Ⅲ組為陰性對照組，投喂不含芽孢桿菌的普通飼料。

1.8 血清抗體效價測定

分別在免疫后的第7、14、21和28天尾靜脈取血，獲得血清樣品。將純化的原核重組蛋白rlip用包被液稀釋至4 μg/mL，4℃包被過夜后，甩去孔內(nèi)液體，PBST洗滌3次。每孔加入100 μL的5% BSA，37℃封閉l h。PBST洗滌3次后，加入待檢的草魚血清(首孔加入8倍稀釋的草魚血清，其余各孔2倍梯度稀釋，100 μL/孔)，37℃孵育l h，PBST洗滌3次。然后，加入鼠抗草魚IgM單克隆抗體(1∶5000倍稀釋)，100 μL/孔，37℃孵育l h后，PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG單克隆抗體(1∶5000倍稀釋)，37℃孵育1 h，100 μL/孔，PBST洗滌6次。加入TMB (博士德，武漢)溶液，100 μL/孔，25℃孵育10 min或直到顯色充分，每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀OD450 nm讀值。

抗體滴度根據(jù)P/N值來確定。P/N=(待檢血清的OD450 nm?空白對照的OD450 nm)/(陰性血清的OD450 nm?空白對照的OD450 nm)。當(dāng)P/N≥2.1時，抗血清的最高稀釋倍數(shù)為其最終抗體滴度。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

1.9 人工感染實驗

免疫后第28天進(jìn)行人工感染，以3.0×107CFU/mL濃度的柱狀黃桿菌G4浸泡感染1 h后，將草魚轉(zhuǎn)移至水族缸中飼養(yǎng)觀察，實驗期間進(jìn)行正常投喂，觀察感染后草魚的活動情況，記錄死亡魚數(shù)量，及時撈走死魚，計算口服免疫對草魚的保護(hù)效果。免疫保護(hù)率計算公式如下：

免疫保護(hù)率=(1–免疫組死亡率/對照組死亡率)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

將雙酶切后的基因片段和雙酶切后的pBE2R質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建了pBE2R-lip載體后，以質(zhì)粒形式轉(zhuǎn)入WB800感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR方法篩選出1個陽性克隆，命名為WB800 (pBE2R-lip)。提取WB800 (pBE2R-lip)的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和Ⅰ雙酶切后進(jìn)行電泳驗證，出現(xiàn)2條不同大小的片段(圖1)，片段大小與預(yù)期相符，經(jīng)測序驗證，與基因的理論序列完全吻合，未發(fā)生移碼。

2.2 目的蛋白的表達(dá)檢測

通過SDS-PAGE電泳實驗，比較了菌株WB800 (pBE2R-lip)和WB800 (pBE2R)不同時間點的蛋白圖譜，發(fā)現(xiàn)二者的分泌蛋白和胞漿蛋白都存在差異，WB800 (pBE2R-lip)菌株在32 kDa的位置多出1個條帶，且48 h樣品比24 h樣品更明顯(圖2)，與經(jīng)氨基酸推導(dǎo)的理論大小一致，可能是基因表達(dá)的蛋白。

圖1 SphⅠ和pstⅠ對質(zhì)粒pBE2R-lip的雙酶切圖譜

圖2 B. subtilis WB800 (pBE2R-lip)和B. subtilis WB800 (pBE2R)的胞漿蛋白和分泌蛋白的SDS-PAGE電泳分析

通過West-blotting實驗發(fā)現(xiàn)，菌株WB800 (pBE2R-lip)的分泌蛋白和胞漿蛋白在32 kDa位置有1條明顯的條帶，WB800 (pBE2R)樣品在相應(yīng)位置無條帶(圖3)，與SDS-PAGE電泳結(jié)果一致。因此，確定基因能在枯草芽胞桿菌中表達(dá)，且能分泌至胞外上清液中。

圖3 B. subtilis WB800 (pBE2R-lip)和B. subtilis WB800 (pBE2R)胞漿蛋白和分泌蛋白West-blotting檢測

2.3 芽孢生成率的計算

測定結(jié)果顯示，用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)WB800 (pBE2R-lip) 48 h后，活菌數(shù)量為3.8×108CFU/mL，芽孢數(shù)量為2.4×108CFU/mL，芽孢生成率為63.2%。

2.4 草魚腸道內(nèi)芽孢桿菌的數(shù)量測定

草魚腸道內(nèi)容物中的芽孢數(shù)量如表1所示，在停喂芽孢桿菌后的第1～2天，草魚腸道內(nèi)容物中檢測到大量的活芽孢，數(shù)量為105～106CFU/g。第3天后，存活芽孢數(shù)量逐漸減少，至第5天僅有很少量的存活體，說明枯草芽孢桿菌的芽孢在進(jìn)入草魚腸道后不能定殖。

表1 草魚腸道內(nèi)容物中芽孢數(shù)量

2.5 血清抗體效價測定

草魚血清中特異性抗體效價見圖4。由圖4可知，從免疫結(jié)束后的第2周開始，實驗Ⅰ組[飼料中含WB800 (pBE2R-lip)]草魚血清中抗體效價開始升高，在第4周達(dá)到最高，其平均值為1∶117.1。在免疫后的第1～4周，實驗Ⅱ組[飼料中含WB800 (pBE2R)]和實驗Ⅲ組(陰性對照組)草魚血清中抗體效價基本沒有變化，在1∶2～1∶4之間。

圖4 草魚血清中特異性抗體檢測

2.6 人工感染實驗

利用柱狀黃桿菌G4株浸泡感染以后，草魚從第2天開始出現(xiàn)死亡，死亡一直持續(xù)到第9天。瀕死草魚的癥狀為身體發(fā)黑、獨游、往充氣頭附近聚集及厭食。在人工感染后的第5天，患病草魚出現(xiàn)鰭條和鰓絲腐爛的現(xiàn)象。從草魚的鰓絲和鰭條進(jìn)行細(xì)菌分離，經(jīng)鑒定為大量的柱狀黃桿菌，說明草魚死亡是由柱狀黃桿菌感染造成的。經(jīng)統(tǒng)計，實驗Ⅰ組[飼料中含WB800 (pBE2R-lip)]草魚的累計死亡率為(43.3±2.7)%，實驗Ⅱ組[飼料中含WB800 (pBE2R)]草魚的累計死亡率為(75.6±6.8)%，實驗Ⅲ組(陰性對照組)草魚的累計死亡率為(91.1±1.6)%(圖5)。據(jù)此可知，WB800 (pBE2R-lip)對草魚的免疫保護(hù)率為52.4%，WB800 (pBE2R)對草魚的免疫保護(hù)率為17.1%。

圖5 受免草魚人工感染柱狀黃桿菌的累計死亡率

3 討論

本研究利用枯草芽孢桿菌表達(dá)柱狀黃桿菌的保護(hù)性抗原基因，提供了一種制備柱狀黃桿菌口服疫苗的新思路。通過聚丙酰胺電泳和免疫印跡實驗證明，WB800 (pBE2R-lip)能有效表達(dá)柱狀黃桿菌基因，且能將lip蛋白分泌至胞外。由于枯草芽孢桿菌具有較強的抗逆性，能抵抗魚類消化道中的不良環(huán)境，將抗原順利輸送至后腸。相對于常規(guī)辦法使用海藻酸鹽、乙基纖維素等基質(zhì)將疫苗進(jìn)行包被而言，枯草芽孢桿菌呈遞抗原具有操作簡單和成本低廉的特點。此外，枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)使用的水產(chǎn)用益生菌，具有較好的安全性。研究結(jié)果顯示，在免疫后的第3周和第4周，免疫組草魚血清中特異性抗體效價顯著高于對照組，說明這種免疫方式能引起草魚的特異性免疫應(yīng)答。在后續(xù)的免疫保護(hù)實驗中發(fā)現(xiàn)，對受免魚具有一定的免疫保護(hù)效果，但該疫苗的免疫保護(hù)率較低，僅為52.4%，這可能與草魚血清中特異性抗體效價較低有關(guān)。陳昌福等(1989)研究表明，通過注射免疫，草魚血清中柱狀黃桿菌的特異性抗體效價可達(dá)到1∶1024，而本研究中，血清抗體效價最高值僅為1∶117.1。黃鈞等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，通過添加免疫佐劑能增強魚類口服免疫的免疫應(yīng)答，而如何篩選合適的免疫佐劑，提高該疫苗口服免疫草魚后血清的特異性抗體效價和免疫保護(hù)率還有待于進(jìn)一步研究。

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Oral Vaccination forAgainstUsingExpressingGene

LUO Zhang1,2, CHEN Honglian1, ZHANG Zhenguo3, HAO Shuang2, HANG Jingang3, SUN Shaoqi4, FENG Shouming3①

(1. Anhui Province Key Laboratory of Aquaculture & Stock Enhancement, Fishery Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei, Anhui 230031, China; 2. Tianjin Fishery Research Institute, Tianjin 300221, China; 3. Prevention and Cure Center for Animal Disease in Tianjin, Tianjin 300221, China; 4. Tianjin Kairun Freshwater Aquaculture Co. Ltd, Tianjin 300221, China)

is used as a probiotic bacterium in aquaculture and has been explored as a live carrier for the expression and oral delivery of antigen proteins., a gram-negative rod-shaped bacterium, is the causative agent of columnaris disease in ?sh. It is ubiquitous in aquatic environments and causes disease in a variety of freshwater ?sh worldwide, which leads to severe economic loss. In a previous study, we discovered a protective antigen gene,against. In this study, thegene was inserted into a shuttle expression vector pBE2R, and then expressed as a recombinant fusion protein inWB800. The expressed protein of 32-kDa, which was estimated using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and western-blotting, was consistent with the molecular weight deduced from amino acid sequence. Grass carp () was immunized through oral administration ofWB800 (pBE2R-). The effects of protection and immune responses were evaluated. Enzyme-linked immunosorbent assay results showed that lip-specific antibodies could be detected in the sera of immunized fish, and the antibody levels were highest in the fourth week, with an average of 1:117. The outcome of immunization withWB800 (pBE2R-) resulted in a relative percent survival of 52.4% against. After being immunizedoral administration, the quantity ofin the hindgut of grass carp was measured using spread plate count method. Results showed thatcould not colonize the gut of grass carp. Our study demonstrated that oral administration ofexpressinggene could produce an effective immune response and offer good resistance against.

;; Grass carp; Oral vaccine

FENG Shouming, E-mail: smfeng65@163.com

S917

A

2095-9869(2021)06-0151-07

10.19663/j.issn2095-9869.20200717001

http://www.yykxjz.cn/

羅璋, 陳紅蓮, 張振國, 郝爽, 韓進(jìn)剛, 孫少起, 馮守明. 枯草芽孢桿菌表達(dá)柱狀黃桿菌基因口服疫苗對草魚免疫保護(hù)效果的研究. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2021, 42(6): 151–157

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馮守明，研究員，E-mail: smfeng65@163.com

2020-07-17,

2020-09-08

*財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、天津市自然科學(xué)基金(16JCYBJC30000)、水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點實驗室開放課題(AHSC20190203)和天津市水產(chǎn)研究所創(chuàng)新團(tuán)隊項目(scyjs201904)共同資助 [This work was supported by China Agriculture Research System of MOF and MARA, Natural Science Foundation of Tianjin (16JCYBJC30000), Open Research Fund Program of Anhui Province Key Laboratory of Aquaculture & Stock Enhancement (AHSC20190203), and Foundation of Tianjin Fishery Research Institute (scyjs201904)]. 羅 璋，E-mail: luozhang2010@163.com

(編輯 馬璀艷)