樊愛芳，白惠玲，劉 勤 ，王芃萱，蘇 萌，張 書

?KEYWORDS:interleukin-35; transforming growth factor-β1; acute anterior uveitis; cytokines; autoimmune disease; human leucocyte antigen-B27

0引言

急性前葡萄膜炎是一類病因及發(fā)病機制非常復(fù)雜的疾病，多項研究表明細胞因子的變化與前葡萄膜炎的發(fā)病、轉(zhuǎn)歸息息相關(guān)[1]。白細胞介素(IL)-35是一種異二聚體蛋白，主要由Treg和Breg細胞分泌，是IL-12細胞因子家族的新成員，IL-35由EBI3和IL-12的p35亞基共價連接，IL-35受體(IL-35R)由IL-12Rβ2 (IL-12R組分)和gp130(IL-27R組分)組成，IL-35與IL-35R結(jié)合后，通過激活JAK(janus activation kinase)家族成員、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)家族成員的活化和核易位來傳遞信號，在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中形成抑炎放大效應(yīng)[2-3]。到目前為止，IL-35作為一種免疫調(diào)節(jié)因子已經(jīng)在多種自身免疫性疾病中被研究，但IL-35并不完全是一種單純的抗炎細胞因子，它在不同炎癥動物模型或人Treg細胞中的作用仍然是矛盾的[4]，IL-35在實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)小鼠中呈現(xiàn)了免疫抑制作用[2]，但IL-35在人類葡萄膜炎中的意義有待進一步研究。此外，Treg細胞還分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，TGF-β1是其中的一種亞型，目前對于TGF-β1的研究比較明確，是人體內(nèi)一種重要的抗炎細胞因子，在葡萄膜炎的進展中具有重要的抑制作用[5]。因此本研究檢測了急性前葡萄膜炎患者血清IL-35、TGF-β1的表達水平，并分析兩者之間的相關(guān)性，評價其在急性前葡萄膜炎中的作用。

1對象和方法

1.1對象納入2018-05/2019-05在甘肅省人民醫(yī)院眼科確診的急性前葡萄膜炎患者30例作為急性前葡萄膜炎組，包括HLA-B27+患者19例(63%，其中合并強直性脊柱炎2例，骶髂關(guān)節(jié)炎1例，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎1例)，特發(fā)性前葡萄膜炎11例(37%)；男17例，女13例；平均年齡36.43±14.73歲。根據(jù)2005年國際葡萄膜炎研究工作組分類[6]及《我國急性前葡萄膜炎臨床診療專家共識(2016年)》診斷標準[7]，通過患者病史，結(jié)合裂隙燈檢查、實驗室檢查確診。納入標準：首次發(fā)病，病程3mo內(nèi)，符合急性前葡萄膜炎的診斷標準。排除標準：(1)繼發(fā)于全葡萄膜炎的前葡萄膜炎；(2)合并其他眼部疾病及反復(fù)發(fā)作史；(3)近1mo內(nèi)服用抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等；(4)合并感染性疾病的患者；(5)合并糖尿病及嚴重肝腎功能不全者。納入同期在我院體檢的健康人30例作為健康對照組，其中男16例，女14例，平均年齡44.27±18.34歲。排除近1mo內(nèi)服用抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等受檢者。兩組受檢者性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.067，P=0.795；t=1.824，P=0.073)。本研究獲得甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會批準(2019-204)，所有受檢者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清樣本收集兩組受檢者均于清晨空腹時，肘靜脈取非抗凝血5mL，室溫下自然凝固后，置37℃溫育箱孵育1h，離心機3 000r/min離心15min，小心吸取血清于EP管中，封口，標記后保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 ELISA測定血清IL-35和TGF-β1水平采用人TGF-β1、IL-35 ELISA試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司，中國)以雙抗體夾心法測定血清IL-35、TGF-β1水平。按照試劑盒說明書完成實驗，根據(jù)標準品通過ELISA Calc軟件繪制標準曲線，計算樣本濃度。

1.2.3前葡萄膜炎嚴重程度評分根據(jù) Hoekzema等[8]改良的 EIU臨床評分標準，在裂隙燈下判定炎癥情況。評分標準：虹膜充血輕度為1分，重度為2分；前房閃輝輕度為1分，重度為2分；前房滲出輕度為1分，重度為2分；前房積膿輕度為1分，重度為2分；瞳孔縮小輕度為1分，重度為2分；總分為10分。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用Shapiro-Wilk法進行正態(tài)分布檢驗，血清細胞因子數(shù)據(jù)資料呈偏態(tài)分布，用M(P25，P75)表達，兩組受檢者血清細胞因子質(zhì)量濃度差異比較采用Mann-WhitneyU檢驗。血清IL-35與TGF-β1表達水平的相關(guān)性及兩者表達水平與疾病嚴重程度(改良的EIU評分)的相關(guān)性均采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

急性前葡萄膜炎患者血清IL-35、TGF-β1的表達水平明顯高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。按照改良的臨床評分標準對納入的急性前葡萄膜炎患者疾病嚴重程度進行評分，最高分為9分，其中0～3分者9例，4～6分者17例，7～9分者4例。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，急性前葡萄膜炎患者血清IL-35、TGF-β1水平與疾病程度均無明顯相關(guān)性(rs=0.087、0.044，P=0.647、0.818)，但血清IL-35與TGF-β1表達水平呈正相關(guān)(rs=0.637，P<0.001，圖1)。

3討論

急性前葡萄膜炎病因及發(fā)病機制復(fù)雜，按病因主要分為感染性和非感染性兩大類，非感染性多見于血清陰性椎關(guān)節(jié)病變伴發(fā)的急性前葡萄膜炎(多數(shù)HLA-B27抗原陽性)、HLA-B27抗原相關(guān)的急性前葡萄膜炎和特發(fā)性急性前葡萄膜炎。本研究納入患者以非感染性為主，其發(fā)病機制多數(shù)觀點認為是由于各種原因使機體自身免疫功能紊亂引起的細胞因子變化，在急性前葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。Treg細胞是控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)的T細胞的一個子集，其主要分泌TGF-β、IL-10、IL-35，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的平衡、預(yù)防自身免疫性和過敏性疾病以及移植后的耐受性誘導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用[9]。TGF-β1是一種重要的免疫抑制性細胞因子，在人體免疫平衡中具有重要作用，其表達水平變化對炎癥發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)具有非常重要的免疫調(diào)控作用。葡萄膜炎患者的臨床癥狀緩解與血清TGF-β1和IL-10水平顯著升高密切相關(guān)，并且與Treg細胞數(shù)量呈正相關(guān)[10]，TGF-β1的增加對炎癥反應(yīng)發(fā)揮著非常重要的負向調(diào)控作用。另外，Th17/Treg及相關(guān)細胞因子平衡也在葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，Th17和Treg相關(guān)因子可以協(xié)同表達，最終趨向于恢復(fù)免疫平衡[11]。因此，本研究中觀察到TGF-β1在急性前葡萄膜炎患者血清表達升高，提示TGF-β1的增加可能是炎癥反應(yīng)中促炎因子釋放，刺激其表達發(fā)揮免疫抑制功能。

IL-35是IL-12家族成員，其成員還包括IL-12、IL-23、IL-27，主要在抗原提呈細胞(APCs)中表達，如巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞，這些細胞因子具有獨特的多向性，在T細胞中起著重要作用，而具有生物活性的IL-35主要由CD4+Foxp3+Treg細胞分泌，與IL-12家族其他成員不同的是，IL-35可以抑制CD4+效應(yīng)T細胞(包括Th1、Th2和Th17)，誘導(dǎo)幼稚T細胞轉(zhuǎn)化為iTr35細胞發(fā)揮抑炎作用[3，12]。IL-35在小鼠中的Treg、CD8+T、γδT細胞中持續(xù)表達，是一種抑制T細胞增殖和預(yù)防自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)劑[3]。而IL-35在人體組織及CD4+Foxp3+Treg細胞中不具有持續(xù)性表達，而是在炎癥刺激下表達，因此，人IL-35的功能似乎是全面抑制炎癥，而不是啟動預(yù)防炎癥[4，13]。迄今為止，多數(shù)關(guān)于IL-35效應(yīng)的研究都是在小鼠實驗?zāi)Ｐ椭羞M行的，Wang等[2]和Kang等[14]發(fā)現(xiàn)IL-35(rIL-35或者i-35外泌體)可以改善EAU小鼠的癥狀，并伴有Th17和Th1細胞的顯著減少和Breg及Treg細胞的擴增，另外IL-35缺乏或IL-35信號通路缺失的小鼠會發(fā)展為嚴重的EAU。關(guān)于人類自身免疫性疾病的報道多集中在原發(fā)性干燥綜合征(Sj?gren’s Syndrome，SS)[15]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)[16]、銀屑性關(guān)節(jié)炎[17]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)[18-19]等，在人葡萄膜炎中的報道較少。Abu El-Asrar等[20]在自身免疫性葡萄膜炎患者房水細胞因子表達譜分析中發(fā)現(xiàn)IL-35參與了HLA-B27相關(guān)性葡萄膜炎的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。有研究表明，RA患者血清IL-35高水平與疾病緩解顯著相關(guān)，病程較長也可能導(dǎo)致血清IL-35水平顯著升高[19]。此外，在Treg細胞與CD4+效應(yīng)T細胞共同培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)EBI3和p35 mRNA的表達明顯上調(diào)[21]，CD4+效應(yīng)T細胞的存在可能是誘導(dǎo)IL-35產(chǎn)生的信號傳遞機制之一。本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，IL-35在急性前葡萄膜炎患者血清中表達明顯升高，但與疾病嚴重程度無明顯相關(guān)性，提示IL-35水平的升高，可能是炎癥發(fā)展時CD4+Th細胞及其促炎因子上調(diào)，其代償性升高發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外，急性前葡萄膜炎患者血清IL-35表達水平與免疫抑制因子TGF-β1的表達水平呈正相關(guān)，提示兩者可能協(xié)同發(fā)揮免疫抑制作用。

表1 兩組受檢者血清IL-35和TGF-β1表達水平 [ M(P25，P75)，ng/L]

圖1 急性前葡萄膜炎患者血清IL-35與TGF-β1表達水平的相關(guān)性。

綜上所述，IL-35主要通過誘導(dǎo)Treg和Breg細胞擴增，增加抑炎因子，抑制CD4+效應(yīng)T細胞相關(guān)促炎因子來調(diào)節(jié)免疫功能，緩解疾病癥狀。也有研究表明IL-35、TGF-β1的升高與疾病的活動狀態(tài)及病程長短相關(guān)，這可能與不同疾病的發(fā)病機制或其參與的信號通路不同有關(guān)。IL-35、TGF-β1在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中可能協(xié)同發(fā)揮作用，但其如何在急性前葡萄膜炎中發(fā)揮作用，需要進一步在Th17及Treg細胞層面及分子機制中詳細研究，為新的治療方法提供理論依據(jù)。