吳靖怡，吳志航，李淑婷，劉 瑤

?KEYWORDS:acyclovir; HTFs; cell proliferation; migration; apoptosis

0引言

青光眼是全球公認(rèn)的視力喪失和失明主要原因之一。青光眼的主要治療方法是通過(guò)局部應(yīng)用降眼壓藥物、激光治療或手術(shù)降低眼壓。青光眼的手術(shù)方法多種多樣。但是，小梁切除術(shù)是公認(rèn)的青光眼的一線外科手術(shù)方法[1]。小梁切除術(shù)的遠(yuǎn)期成功率較低的主要原因是術(shù)后濾過(guò)泡瘢痕的形成阻礙房水外引流[2-3]。目前術(shù)中使用抗代謝藥物如5-氟尿嘧啶(5-FU)和絲裂霉素-C(MMC)能夠部分減輕術(shù)后濾過(guò)泡的瘢痕愈合[4]。但是，5-FU和MMC的使用增加了濾過(guò)泡形成不良、濾過(guò)過(guò)暢、角膜緣干細(xì)胞功能的衰竭以及眼內(nèi)炎等藥物相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率[4-5]。多種抗病毒藥物已被報(bào)道通過(guò)不同機(jī)制直接參與細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒性活動(dòng)[6-7]。阿昔洛韋(ACV)是臨床常用抗病毒藥物，但是目前阿昔洛韋對(duì)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞(HTFs)的作用尚無(wú)相關(guān)研究。本研究應(yīng)用ACV作用于體外培養(yǎng)HTFs，旨在探索ACV對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和遷移影響，為減少青光眼術(shù)后濾過(guò)泡瘢痕化，提高青光眼濾過(guò)術(shù)的成功率提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)并獲得患者及其家屬的知情同意。取玻璃體切除手術(shù)患者的Tenon囊組織，剪碎，加入0.25%膠原酶Ⅳ(美國(guó)Gibco公司)，孵育2h；離心，加入胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，孵育30min；200目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心，加入培養(yǎng)基[含20%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，含1%雙抗(美國(guó)Gibco公司)的DMEM-F12(美國(guó)Gibco公司)]；待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿80%時(shí)即可傳代。傳代后使用含10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM-F12的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞使用免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定(免疫熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)，德國(guó)Leica)，免疫熒光一抗采用1∶300小鼠抗人單克隆抗體波形蛋白(美國(guó)Genetex)，二抗采用1∶500山羊抗小鼠單克隆抗體(IgG)(美國(guó)Proteintech)。取3至5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1 CCK8檢測(cè)收集HTFs制成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中；細(xì)胞貼壁后換無(wú)血清DMEM-F12培養(yǎng)24h；隨機(jī)分為ACV處理組，空白組以及標(biāo)準(zhǔn)組；ACV處理組加入ACV終濃度分別為0.45、1.125、2.25、3.375、4.5mmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基，空白組加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)組為無(wú)成纖維細(xì)胞孔加入無(wú)血清DMEM-F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h；加入CCK8試劑，孵育4h；酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特公司)測(cè)定490nm處的吸光度(A490)。計(jì)算出不同濃度阿昔洛韋對(duì)HTFs的抑制率，抑制率=(實(shí)驗(yàn)組A490值-標(biāo)準(zhǔn)組A490值)/(對(duì)照組A490值-標(biāo)準(zhǔn)組A490值)×100%。

1.2.2劃痕實(shí)驗(yàn)收集HTFs制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；100μL槍尖劃痕；隨機(jī)分為ACV處理組和空白組。ACV處理組加入ACV終濃度分別為2.25、4.5mmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基，空白組加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。0、72h取樣，拍照(相差顯微鏡，日本Olympus公司)。采用Image-J軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕距。計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率(%)=(T0h寬度-T72h寬度)/T0h寬度×100%。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)收集4.5mmol/L ACV處理24h后HTFs和空白組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分成兩部分，一部分加入YF488-Annexin V和PI工作液(Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒, 美國(guó)EVERBRIGHT)，避光孵育15min，測(cè)定細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。另一部分細(xì)胞加入預(yù)冷75%乙醇，置于-4℃固定過(guò)夜。后加入碘化丙啶染色液(細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒,美國(guó)EVERBRIGHT)，避光孵育15min，測(cè)定細(xì)胞周期(流式細(xì)胞儀,美國(guó)BD)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Graphpad Prism 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞免疫熒光鑒定酶消化法取原代HTFs，培養(yǎng)4～5d可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，生長(zhǎng)良好，符合HTFs形態(tài)；采用免疫熒光進(jìn)行細(xì)胞鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為HTFs，免疫熒光顯微鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞胞質(zhì)中波形蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，胞質(zhì)內(nèi)呈綠色染色，見(jiàn)圖1。

2.2 ACV對(duì)HTFs增殖的影響CCK8檢測(cè)顯示，不同濃度ACV作用于HTFs的A490值,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=54.8，P<0.0001)。與空白組對(duì)比，ACV濃度為0.45mmol/L時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.4604，P=0.6551)；當(dāng)ACV濃度為1.125、2.25、3.375、4.5mmol/L時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.946，P=0.0027；t=4.660，P=0.0009；t=8.057，P<0.0001；t=12.95，P<0.0001)，見(jiàn)表1。ACV濃度為1.125mmol/L與2.25、3.375、4.5mmol/L組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004、=0.005、<0.0001、<0.0001)。結(jié)果顯示當(dāng)ACV濃度達(dá)到1.125mmol/L時(shí)，開(kāi)始對(duì)HTFs有抑制作用，并呈濃度依賴性。

2.3 ACV對(duì)HTFs遷移活性的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度ACV作用于HTFs的細(xì)胞遷移率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.23,P=0.0074)，見(jiàn)表1。2.25、4.5mmol/L ACV組細(xì)胞遷移率與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.303,P=0.005；t=5.019,P=0.0074)。ACV濃度為2.25mmol/L與4.5mmol/L組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.495，P=0.025)，見(jiàn)圖2、3。結(jié)果顯示ACV對(duì)HTFs的遷移活性有抑制作用，并且隨著ACV濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。

2.4 ACV對(duì)HTFs凋亡和細(xì)胞周期的影響經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，空白組細(xì)胞凋亡率(2.29%±0.24%)與4.5mmol/L ACV處理組(7.35%±0.64%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.33,P=0.0005)，見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示4.5mmol/L ACV作用HTFs 24h后，HTFs細(xì)胞凋亡增加。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，空白組(G0/G1期59.97%±2.13%；S期23.64%±1.89%)與ACV處理組(G0/G1期74.8%±1.27%；S期8.77%±0.93%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.434,P=0.0011；t=9.953,P=0.0006)，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示4.5mmol/L ACV作用HTFs 24h后，G0/G1期峰值升高，S期峰值下降，HTFs細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

3討論

濾過(guò)泡瘢痕的生成主要由HTFs的異常增殖、以及其向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，分泌膠原和促纖維化因子的能力增強(qiáng)及細(xì)胞外基質(zhì)的合成增多等引起[8]。目前術(shù)中使用抗代謝物減輕術(shù)后濾過(guò)泡的瘢痕的生成。但是，抗代謝物的使用增加了藥物相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率[4-5]。因此，發(fā)現(xiàn)更安全有效的瘢痕抑制劑對(duì)提高青光眼濾過(guò)手術(shù)的遠(yuǎn)期成功率有深刻意義。

目前，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)抗病毒藥物可通過(guò)抑制細(xì)胞增生和促進(jìn)其凋亡參與細(xì)胞抑制。如西多福韋可以促進(jìn)未感染病毒的間皮瘤細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白p53、caspase-3等的升高，生存蛋白Bcl-x的降低[9]；利巴韋林可通過(guò)減少eIF4E靶點(diǎn)的mRNA輸出和蛋白表達(dá)從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[10]。已有研究證實(shí)抗病毒藥物IFNγ對(duì)HTFs的增殖具有明顯的抑制作用。IFNα-2b能夠通過(guò)減少HTFs中TGF-β1、TGF-β2的表達(dá)，從而減少Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白的表達(dá)，參與抑制HTFs的增殖[11-12]。ACV是一種合成鳥(niǎo)苷類(lèi)似物，作為傳統(tǒng)抗病毒藥物，阿昔洛韋滴眼液在眼科局部應(yīng)用有長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)，安全性高，耐受性良好[13-14]。Benedetti等[15]發(fā)現(xiàn)ACV可以抑制白血病細(xì)胞的活性并誘導(dǎo)其凋亡，并且用ACV預(yù)處理白血病細(xì)胞，可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。但目前ACV對(duì)HTFs的作用尚無(wú)相關(guān)研究。

ACV微溶于水，在水中的溶解性為3.3～5.7mmol/L，隨著溫度的改變而改變[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，當(dāng)ACV濃度高于4.5mmol/L時(shí),溶液有沉淀析出。因此，本實(shí)驗(yàn)采用ACV最大濃度為4.5mmol/L。首先，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK8證實(shí)ACV抑制HTFs增殖。選擇不同濃度ACV作用于HTFs，CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示ACV對(duì)HTFs有抑制作用，并且隨著ACV濃度的增長(zhǎng)，對(duì)HTFs的抑制作用逐漸增強(qiáng)。在后續(xù)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測(cè)中，采用本實(shí)驗(yàn)中ACV的最高藥物濃度4.5mmol/L。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，ACV處理后，HTFs細(xì)胞周期G0/G1期的峰值增高，S期下降，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并且細(xì)胞凋亡率明顯升高。提示ACV可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期，抑制HTFs的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ACV對(duì)HTFs向周邊的遷移具有明顯的抑制作用。成纖維細(xì)胞可通過(guò)遷徙、增殖、分泌膠原等生物學(xué)行為參與創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程[18]。因此通過(guò)減弱成纖維細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng),進(jìn)一步減少其增殖,可以減輕瘢痕的生成。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射ACV后，腎臟組織的VEGF及其受體以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)表達(dá)水平降低[19]。提示ACV可以抑制VEGF及其受體的生成。VEGF被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)最常見(jiàn)的刺激因子[20]。有研究發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體在HTFs中呈高表達(dá)，VEGF可直接促進(jìn)HTFs的增生和遷移[21]。Park等[22]研究表明，VEGF誘導(dǎo)TGF-β1蛋白的產(chǎn)生，并且呈劑量依賴性。TGF-β被認(rèn)為是青光眼濾過(guò)術(shù)后瘢痕形成的關(guān)鍵因子。由此推測(cè)ACV可能通過(guò)抑制VEGF從而降低TGF-β1的水平，進(jìn)而抑制HTFs的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，與干擾素類(lèi)似。

圖1 細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果 A:原代人Tenon囊成纖維細(xì)胞(×40)；B:HTFs免疫熒光鑒定(×400)。

圖2 不同濃度ACV作用抑制HTFs的細(xì)胞遷移(×400)。

表1 不同濃度阿昔洛韋作用后對(duì)HTFs的抑制作用和遷移活性的影響

圖3 不同濃度ACV作用72h對(duì)HTFs遷移率的影響。

圖4 4.5mmol/L ACV誘導(dǎo)HTFs凋亡結(jié)果 A：空白對(duì)照組；B:4.5mmol/L ACV處理組。

圖5 4.5mmol/L ACV阻滯HTFs細(xì)胞周期結(jié)果 A：空白對(duì)照組；B:4.5mmol/L ACV處理組。

綜上所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以得出如下初步結(jié)論:ACV可以通過(guò)誘導(dǎo)HTFs細(xì)胞周期阻滯，抑制HTFs的增殖，從而誘導(dǎo)其凋亡，并且能通過(guò)削弱HTFs的遷移能力抑制HTFs向周邊侵襲和轉(zhuǎn)移。這一研究結(jié)果有望應(yīng)用于青光眼術(shù)后抑制濾過(guò)泡瘢痕化，為提高青光眼濾過(guò)術(shù)長(zhǎng)期成功率提供新思路。本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)一步深入探討ACV阻滯細(xì)胞周期的作用機(jī)制，其確切的信號(hào)通路有待進(jìn)一步研究。并且ACV能否提高5-FU對(duì)于青光眼術(shù)后成纖維細(xì)胞的敏感性，有望在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步深入探討。