賀 琳，焦云娟，馬高恩，李艷華，李曉鵬

?KEYWORDS:resveratrol; glaucoma; optic nerve injury; phosphatidylinositol 3 kinase; protein kinase B

0引言

青光眼是繼白內(nèi)障之后的第二大致盲性眼病，以視神經(jīng)乳頭凹陷性萎縮和視野特征性缺損性縮小為主要表現(xiàn)，不僅影響患者的視力健康和生活質(zhì)量，也造成了一定的社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。多項(xiàng)研究表明，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGC)凋亡和神經(jīng)軸突的退變是青光眼的主要病變特點(diǎn)[2-4]，因此減少或抑制RGC凋亡與軸突的退變成為青光眼治療的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)青光眼的治療方式為手術(shù)或藥物降壓，但部分患者在眼壓正常后仍存在繼發(fā)性視神經(jīng)損傷。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)等多種作用。既往研究證實(shí)，白藜蘆醇可減輕青光眼視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激損傷，但未具體闡述對(duì)RGC凋亡的影響及相關(guān)調(diào)控機(jī)制[5]。故此，本研究通過建立青光眼大鼠模型，分析白藜蘆醇對(duì)青光眼大鼠視神經(jīng)損傷的保護(hù)作用以及對(duì)凋亡相關(guān)信號(hào)通路磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)及其相關(guān)因子的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康無(wú)眼疾SPF級(jí)SD大鼠，8周齡，60只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SCXK(冀)2018-003。自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1wk。飼養(yǎng)環(huán)境室溫23℃～25℃，濕度45%～55%，12h明/暗交替光照。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2018-085)。

1.1.2主要儀器及試劑白藜蘆醇(美國(guó)Sigma公司)，熒光金(美國(guó)Biotium公司)，0.25%氯霉素眼液(山東省人民藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20063685)，0.5%鹽酸丙美卡因眼液(比利時(shí)愛爾康醫(yī)藥公司，批準(zhǔn)文號(hào)H20090082)，超純RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量分析試劑盒(廣州邁博生物科技有限公司)，兔抗大鼠PI3K、磷酸化(phosphorylation，p)-PI3K、Akt、p-Akt、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)多克隆抗體(北京Jackson公司)；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司)，全段酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1熒光金染料逆行標(biāo)記追蹤RGC取60只大鼠，0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上，以Paxinos圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，定位器調(diào)整至零后，后移6.0mm，在兩側(cè)旁開中線1.5mm處對(duì)稱點(diǎn)，制作大小約1mm的骨孔，撕開骨孔處硬腦膜，Bregma點(diǎn)為零點(diǎn)后移4.3、6.3mm的骨孔內(nèi)，分別旁開4.4、1.4mm，于背側(cè)膝狀核和上丘內(nèi)分別以玻璃微管緩慢注入3%熒光金0.5μL，注射深度分別為4.5、3.5mm，于5min內(nèi)注射完畢，針頭留置10min。對(duì)側(cè)背外側(cè)膝狀核和上丘操作同上，術(shù)畢分層縫合筋膜和皮膚，大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，保持墊料干燥。

1.2.2青光眼大鼠模型制備60只大鼠行熒光金染料逆行標(biāo)記追蹤RGC 4d后以0.25%氯霉素眼液滴注右眼，1滴/次，2次/天，連續(xù)3d。熒光金染料逆行標(biāo)記追蹤RGC 7d后，隨機(jī)取40只大鼠，采用燒灼鞏膜表面靜脈法均選取右眼制作青光眼模型[6]：建模當(dāng)天大鼠稱重，仰臥于手術(shù)臺(tái)后固定，以0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射，并以0.5%鹽酸丙美卡因眼液滴注術(shù)眼3次，常規(guī)消毒鋪巾，暴露右眼。在眼科顯微鏡下，距角鞏膜緣12∶00方向剪開上方球結(jié)膜，約1mm，鈍性分離球結(jié)膜及筋膜，暴露鞏膜靜脈，分離3支上鞏膜靜脈，以手術(shù)燒灼器輕輕烙閉，以近角膜端血管擴(kuò)張充盈，遠(yuǎn)角膜端血管血流消失為宜。后整復(fù)術(shù)眼球結(jié)膜及筋膜，涂抹金霉素軟膏，術(shù)后第2d以0.25%氯霉素眼液滴眼，1滴/次，2次/天，連續(xù)7d。左眼不做處理。余20只大鼠除未燒灼上鞏膜靜脈外，其余步驟相同。

1.2.3分組及干預(yù)取建模成功(燒灼鞏膜表面靜脈術(shù)后7d檢測(cè)眼壓大于21mmHg或術(shù)眼眼壓高于非手術(shù)眼5mmHg視為建模成功)大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，20只未燒灼上鞏膜靜脈大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(10只)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定白藜蘆醇濃度，低、中、高劑量組分別以白藜蘆醇10、20、40mg/kg腹腔注射(10mL/kg)，藥物注射劑量按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]人與大鼠體表面積的藥物等效劑量換算，注射間隔依據(jù)白藜蘆醇給藥后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)[8]，1次/天，連續(xù)8d。模型組、對(duì)照組在相同時(shí)間注射等量生理鹽水，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組則給予白藜蘆醇10mg/kg腹腔注射。

1.2.4眼壓測(cè)量末次給藥后2h，以毛巾包裹大鼠并固定于手術(shù)臺(tái)，0.5%鹽酸丙美卡因眼液滴眼表面麻醉，將眼壓計(jì)筆頭垂直接觸大鼠右側(cè)角膜正中，測(cè)量大鼠右側(cè)眼壓，連續(xù)測(cè)量3次，計(jì)算平均值。

1.2.5視網(wǎng)膜鋪片與RGC計(jì)數(shù)眼壓測(cè)量后，以頸椎脫臼法迅速處死大鼠，顯微剪剪開大鼠球結(jié)膜，分離結(jié)膜和鞏膜，斷開眼外肌，取出眼球鈍性分離視神經(jīng)約5mm，取1/2以4%多聚甲醛固定2h，顯微鏡下去除眼前節(jié)，分離視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜平鋪于載玻片，自然干燥后以75%緩沖甘油封片，于3h內(nèi)在熒光顯微鏡下觀察。以距視乳溝2mm的上、下、左、右各4個(gè)視野各留1張照片，Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)被標(biāo)記的RGC，計(jì)算RGC標(biāo)識(shí)率，RGC標(biāo)識(shí)率(%)=每只大鼠右眼RGC/左眼RGC×100%。

1.2.6視網(wǎng)膜組織相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量剩余視網(wǎng)膜保存于-80℃冰箱，用時(shí)取出以超純RNA提取試劑盒提出總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR法檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)情況，配制20μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 10min，95℃ 15s，58℃ 50s，58℃ 50s，45個(gè)循環(huán)，β-actin為內(nèi)參基因，2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。所有樣本重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值。引物序列見表1。

1.2.7視網(wǎng)膜組織相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量取-80℃保存的視網(wǎng)膜組織，裂解提取蛋白，BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)進(jìn)行蛋白定量，35μg樣本蛋白混合等體積上樣，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉液封閉，室溫孵育2h，加入PI3K(1∶800)、Akt(1∶500)、bFGF(1∶500)、BDNF(1∶800)一抗，4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育45min，加入底物顯色，LabWorks軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶β-actin比值表示目的蛋白的表達(dá)水平，計(jì)算p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、p-BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量。

圖1 熒光金逆行標(biāo)記神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活情況(×200) A：對(duì)照組；B：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；C：模型組；D：低劑量組；E：中劑量組；F：高劑量組。

表1 引物序列

2結(jié)果

2.1各組大鼠眼壓比較末次給藥后2h，各組大鼠眼壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組眼壓更高(均P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組眼壓更低(均P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組與高劑量組眼壓更低(均P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組眼壓更低(P<0.05)；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組眼壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.2各組大鼠RGC存活情況比較各組大鼠的RGC標(biāo)識(shí)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組RGC標(biāo)識(shí)率更低(均P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組RGC標(biāo)識(shí)率更高(均P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組RGC標(biāo)識(shí)率更高(均P<0.05)，與中低劑量組比較，高劑量組RGC標(biāo)識(shí)率更高(P<0.05)；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組RGC標(biāo)識(shí)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1，表2。

2.3各組大鼠視網(wǎng)膜組織相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量比較各組大鼠視網(wǎng)膜PI3K、Akt mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠視網(wǎng)膜bFGF、BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組bFGF、BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量更低(均P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組bFGF、BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量更高(均P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組bFGF、BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量更高(均P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組bFGF、BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量更高(均P<0.05)，見表3。

表2 各組大鼠眼壓和RGC存活情況

2.4各組大鼠視網(wǎng)膜組織相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較各組大鼠視網(wǎng)膜p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量更低(均P<0.05)；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量更高(均P<0.05)；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量更高(均P<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量更高(均P<0.05)，見圖2，表4。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織相關(guān)mRNA相對(duì)表達(dá)量

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果。

3討論

眼壓升高是導(dǎo)致青光眼的主要危險(xiǎn)因素，可引起RGC凋亡，視功能損害，視野變窄，最終導(dǎo)致不可逆的視覺功能喪失[9]。目前臨床對(duì)于青光眼的治療多采用降低眼壓的措施，雖可獲得一定的效果，但不足以防治RGC損傷和凋亡。RGC的損傷、凋亡與氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子、凋亡因子水平失衡等多種因素有關(guān)。研究證實(shí)，調(diào)節(jié)相關(guān)因子可抑制RGC凋亡，改善視神經(jīng)功能[10]，但尚未出現(xiàn)療效確切穩(wěn)定的視神經(jīng)保護(hù)藥物抑制RGC損傷，防止視力進(jìn)一步下降。因此，尋求一種有效的RGC保護(hù)藥物，對(duì)于青光眼的治療具有重要意義。

白藜蘆醇是葡萄、藍(lán)莓、蔓越莓等植物在受刺激時(shí)產(chǎn)生的抗毒素，為非黃酮類多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗菌及保護(hù)心血管的作用。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的多重耐藥，增加癌細(xì)胞對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療藥物的敏感性，發(fā)揮抗癌作用[11]。陳歡等[12]研究證實(shí)，白藜蘆醇能減輕氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。龐博等[13]認(rèn)為，白藜蘆醇可減輕丙泊酚所致大鼠神經(jīng)元損傷。以上研究說明，白藜蘆醇具有神經(jīng)功能保護(hù)作用。本研究結(jié)果中，與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠眼壓更低，RGC標(biāo)識(shí)率更高；與低劑量組比較，中劑量組與高劑量組眼壓更低，RGC標(biāo)識(shí)率更高；與中劑量組比較，高劑量組眼壓更低，RGC標(biāo)識(shí)率更高，提示白藜蘆醇能降低青光眼大鼠眼壓，抑制RGC凋亡，與既往研究觀點(diǎn)一致。

細(xì)胞凋亡涉及DNA片段的斷裂與蛋白的表達(dá)，此過程受細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞存活的重要信號(hào)通路，對(duì)于維持細(xì)胞生長(zhǎng)和存活、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生具有重要作用[14]。PI3K為T淋巴細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，能經(jīng)催化底物磷酸脂酰肌醇被磷酸化激活，將活化的信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)[15]。Akt不僅是PI3K的下游靶蛋白，還是細(xì)胞存活信號(hào)通路的樞紐酶，可傳遞生長(zhǎng)因子等細(xì)胞外刺激信號(hào)，在細(xì)胞受到外界因子刺激時(shí)，Akt被磷酸化激活后進(jìn)入細(xì)胞核，通過多種途徑磷酸化其下游蛋白，發(fā)揮抗凋亡作用[16]。磷酸化的Akt能激活下游Fas死亡受體通路，將細(xì)胞外死亡信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[17]。賴文芳等[18]研究證實(shí)，通過提高PI3K、Akt蛋白的表達(dá)可減輕腦卒中大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。bFGF、BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞與其軸突的生長(zhǎng)，增加突觸的可塑性和神經(jīng)發(fā)生，通過增加視網(wǎng)膜內(nèi)bFGF、BDNF水平，提高RGC存活率[19-20]。研究證實(shí)，提高大鼠海馬CA1區(qū)BDNF和bFGF的蛋白表達(dá)水平能促進(jìn)神經(jīng)元的恢復(fù)[21]。本研究結(jié)果中，與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組視網(wǎng)膜p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量更高；與低劑量組比較，中劑量組與高劑量組視網(wǎng)膜p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量更高；與中劑量組比較，高劑量組視網(wǎng)膜p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白比值及bFGF、BDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量更高。以上分析與結(jié)果說明，白藜蘆醇能降低青光眼大鼠眼內(nèi)壓，抑制RGC凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)PI3K、Akt蛋白磷酸化與bFGF、BDNF基因及蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，白藜蘆醇能抑制青光眼大鼠RGC的凋亡，減輕視神經(jīng)損傷，其機(jī)制可能與上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化及視神經(jīng)保護(hù)作用因子基因與蛋白的表達(dá)有關(guān)。在今后青光眼治療相關(guān)藥物研發(fā)中，可將白藜蘆醇納入選擇標(biāo)準(zhǔn)。