朱新華 吳兆坤 袁家勝 余娟 戴美娜 鮑有為 朱玉

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是特應(yīng)性個體暴露于相應(yīng)變應(yīng)原的環(huán)境中，IgE介導(dǎo)的炎性細(xì)胞向炎癥部位遷移，由免疫活性細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等共同參與的鼻部Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，屬慢性非感染性疾病，亦是全球性健康問題[1]。有研究表明AR與抑郁情緒相關(guān)，青春期AR對精神抑郁的發(fā)展起了重要的作用，這種影響一直到青春期后期和成年[2，3]，AR的發(fā)病機(jī)制與炎癥細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子有關(guān)，肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞是其主要的作用細(xì)胞。CC趨化因子受體3（CCR3）在AR的病理生理過程中起主要作用。AR的炎癥浸潤主要由嗜酸性粒細(xì)胞、Th2細(xì)胞和肥大細(xì)胞組成，這些細(xì)胞表面均表達(dá)CCR3。實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)CCR3通路在體內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞活性中起著重要作用，同時也證明了CCR3在變應(yīng)性氣道疾病中明顯增加[4]。本研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用RNAi沉默CCR3，發(fā)現(xiàn)可抑制小鼠嗜酸性粒細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[5]。亦有研究發(fā)現(xiàn)：敲除CCR3基因可通過下調(diào)EPO、ECP、MBP、IL-4和IgE的表達(dá)，減少AR小鼠侵襲性EOS的數(shù)量和炎癥反應(yīng)[6]。變應(yīng)性哮喘的發(fā)病機(jī)制與變應(yīng)性鼻炎相似，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生及釋放的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子均與CCR3密切相關(guān)，CCR3單克隆抗體（CCR3 mAb）是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對CCR3抗原表位的抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)制備產(chǎn)生，它能夠特異性作用于CCR3表面抗原，抑制其對下游細(xì)胞的作用。有研究證實(shí)：經(jīng)腹腔注射CCR3單克隆抗體對變應(yīng)性哮喘小鼠的癥狀及與炎癥相關(guān)的指標(biāo)均有明顯改善作用[7-9]?；凇敖y(tǒng)一氣道疾病”的理論，同樣使用CCR3單克隆抗體對變應(yīng)性鼻炎也可能產(chǎn)生同樣效果。但目前CCR3單克隆應(yīng)用于變應(yīng)性鼻炎，特別是經(jīng)鼻腔滴入是否對變應(yīng)性鼻炎產(chǎn)生作用且其機(jī)制如何？文獻(xiàn)報道尚不多見。

本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建小鼠變應(yīng)性鼻炎模型的基礎(chǔ)上，通過經(jīng)鼻腔滴入及腹腔注射兩種途徑給予CCR3 mAb，觀察鼻腔黏膜的組織形態(tài)學(xué)變化、炎癥浸潤情況，并用ELISA檢測相關(guān)炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的變化，初步探討CCR3 mAb抑制CCR3對變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜產(chǎn)生的相關(guān)作用及其機(jī)制。

資料及方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物為6～8周Balb/c雄性健康小鼠，體重為25～35g，購自于江西省南昌市南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動科部，所有動物飼養(yǎng)于南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)動物房，飼養(yǎng)于20℃恒溫環(huán)境，以標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料及高溫滅菌飲用水飼養(yǎng)。卵清蛋白（OVA）（美國sigma公司），ELISA試劑盒等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將Balb/c小鼠分為4組：①正常小鼠組（Normal），②變應(yīng)性鼻炎組（AR），③CCR3單克隆抗體滴鼻組（ND），④CCR3單克隆抗體腹腔注射組（IP），每組白鼠5只，共20只。

2.2 變應(yīng)性鼻炎動物模型的建立

以6～8周雄性BALB/c小鼠于第1、8、15d經(jīng)腹腔注射致敏液200 ul（100ugOVA和4 mgAL（0H）3），每天1次，行基礎(chǔ)致敏，第20～26d以激發(fā)液20 ul（600ugOVA），10ul/側(cè)滴鼻激發(fā)，每天2次，構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎小鼠模型。

2.3 CCR3 mAb干擾

于第24～26d以CCR3mAb干擾，具體干擾方法如下：（1）經(jīng)鼻腔滴入：第③組小鼠給予25 mg/kg鼠抗鼠CCR3 mAb溶于PBS溶液行滴鼻干擾，每天2次，間隔不少于8h。（2）腹腔注射：第④組小鼠給予12.5 mg/kg鼠抗鼠CCR3單抗溶于PBS溶液腹腔注射，每天2次（左右分次注射），干擾在激發(fā)前30min進(jìn)行。（3）正常對照組：均用相同劑量的PBS處理。

2.4 收集小鼠鼻黏膜做好標(biāo)記后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，取小鼠鼻黏膜、組織進(jìn)行HE染色及免疫組化檢查。

2.5 ELISA檢測鼻黏膜組織中組胺和相關(guān)炎癥及細(xì)胞因子的濃度（IL-2、TNF-α、IL-4、IL-10）

3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 23及GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中計(jì)量資料采用（Mean±SEM）表示，各組數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性分析，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則進(jìn)行非參數(shù)多重秩和檢驗(yàn)。

結(jié)果

1 各組小鼠行為學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析

最后一次小鼠鼻腔OVA激發(fā)后，計(jì)數(shù)10 min內(nèi)打噴嚏及抓鼻次數(shù)（表1）。通過行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性鼻炎組（AR組）出現(xiàn)了明顯的抓鼻及打噴嚏的癥狀，平均每17.8s就有一次抓鼻動作；每8.7s就有一次噴嚏。而CCR3mAb腹腔注射組（IP組）和CCR3mAb鼻腔滴入組（ND組）也有明顯的抓鼻及噴嚏，但是相比于AR組明顯減輕，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為抓鼻：P=0.0009、P=0.0004；噴嚏：P=0.027、P=0.014），但是均較正對照組為高，尤其是變應(yīng)性鼻炎組（所有P＜0.05）。而CCR3mAb腹腔注射組和CCR3mAb鼻腔滴入組之間小鼠的噴嚏及抓鼻計(jì)數(shù)無顯著性差異（圖1，圖2）。小鼠行為學(xué)觀察與分析表明運(yùn)用CCR3mAb后能夠有效控制變應(yīng)性鼻炎的癥狀。

表1 鼻腔激發(fā)后噴嚏及抓鼻計(jì)數(shù)（n=5) bP＜0.05 vs Normal mice;eP＜0.05 vs ARmice

圖1 鼻腔激發(fā)后小鼠抓鼻計(jì)數(shù)

圖2 鼻腔激發(fā)后小鼠噴嚏計(jì)數(shù)

2 小鼠鼻黏膜HE染色檢測

成功構(gòu)建變應(yīng)性小鼠模型后，HE染色觀察比較各組小鼠鼻黏膜組織的病理形態(tài)學(xué)變化及炎性細(xì)胞浸潤情況。小鼠鼻黏膜組織形態(tài)與炎性細(xì)胞浸潤均置于高倍鏡下（400×）的視野中觀察。結(jié)果顯示：正常對照組：鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)清晰、完整、表面光滑、黏膜及黏膜下組織未見明顯腫脹，組織中極少量炎性細(xì)胞浸潤，鼻黏膜固有層中腺體未見明顯擴(kuò)張，黏膜表面纖毛清晰可見，排列整齊（圖3A）；變應(yīng)性鼻炎組：鼻黏膜結(jié)構(gòu)不清，大量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜及黏膜下層腫脹明顯，分界不清，表面纖毛破壞、排列紊亂、脫落，部分上皮破損，脫離（圖3B），與正常對照組相比顯示出明顯的炎癥性表現(xiàn)；CCR3mAb腹腔注射組和CCR3mAb鼻腔滴入組：鼻黏膜的整體結(jié)構(gòu)尚清晰，黏膜及黏膜下層分界尚可分辨，黏膜及黏膜下組織中浸潤的炎癥細(xì)胞較變應(yīng)性鼻炎組明顯減輕，但是CCR3mAb腹腔注射組與CCR3mAb鼻腔滴入組進(jìn)行對比，黏膜排列稍整齊，炎癥浸潤無明顯差異（圖3C、圖3D）。變應(yīng)性鼻炎小鼠運(yùn)用CCR3mAb，無論是腹腔注射，還是經(jīng)鼻腔滴入對變應(yīng)性鼻炎小鼠的鼻黏膜炎癥均有抑制作用，不僅可以減輕炎癥細(xì)胞的浸潤；還可以使腫脹的黏膜及其表面紊亂的纖毛得到一定程度的恢復(fù)。

圖3 小鼠鼻黏膜的HE染色結(jié)果

3 小鼠鼻黏膜免疫組化檢測炎性細(xì)胞浸潤情況

免疫組化觀察比較各組小鼠鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的抗體是Siglec-F單克隆抗體，Siglec-F表達(dá)于小鼠嗜酸性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞表面[10，11]。鼻黏膜組織中肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況置于高倍鏡下（400×）觀察。鼻黏膜的免疫組化顯示：變應(yīng)性鼻炎組炎性細(xì)胞浸潤及黏膜破壞情況最為明顯（圖4 B），CCR3mAb腹腔注射組和CCR3mAb鼻腔滴入組小鼠，這兩組的黏膜破壞及炎性細(xì)胞浸潤情況均較變應(yīng)性鼻炎為輕（圖4C、圖4D）；正常對照組顯示的是正常鼻黏膜組織（圖4A），表明CCR3mAb應(yīng)用可減少肥大細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞向變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜的遷移浸潤。

圖4 小鼠肺鼻黏膜的免疫組化結(jié)果

4 ELISA檢測血清、鼻黏膜中組胺和相關(guān)炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的表達(dá)水平[12]

運(yùn)用ELISA檢測變應(yīng)性鼻炎小鼠給予CCR3 mAb干擾后對鼻黏膜中各種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的表達(dá)水平（HIS、IL-2、TNF-α、IgE、IL-10）。結(jié)果顯示：變應(yīng)性鼻炎組相關(guān)炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子表達(dá)量均明顯高于空白對照組、CCR3mAb腹腔注射組及CCR3mAb鼻腔滴入組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5，表2）。表明CCR3mAb運(yùn)用于變應(yīng)性鼻炎，可抑制相關(guān)炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的促炎作用。

表2 鼻黏膜中組胺和IL-2、TNF-α、IgE、IL-10的ELISA檢測結(jié)果

圖5 小鼠外周血、鼻黏膜及肺肺組織中IL-10水平的ELISA檢測結(jié)果

討論

變應(yīng)性鼻炎（Allergic rhinitis，AR）影響全球發(fā)病率約20%，是一種慢性非感染性疾病，有證據(jù)表明，全球過敏性疾病正在逐年增加[13]。而AR的發(fā)病涉及多種炎性細(xì)胞活化及炎癥介質(zhì)的合成及分泌，機(jī)制復(fù)雜，且各種信號級聯(lián)之間相互作用及影響。而EOS趨化因子-趨化因子受體3軸（Eotaxin-CCR3）是其中的一個重要通路，在炎癥狀態(tài)下，EOS通過Eotaxin-CCR3由造血干細(xì)胞分化、成熟并募集到炎癥部位。EOS、Th2細(xì)胞和肥大細(xì)胞等表面均表達(dá)CCR3，在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生與發(fā)展起關(guān)鍵性作用。有研究運(yùn)用RNA干擾（RNAi）沉默CCR3發(fā)現(xiàn)：①CCR3 RNAi在體內(nèi)外均能有效抑制CCR3 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)EOS的凋亡，抑制其生長、遷移和侵襲，②可減輕AR動物模型中鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)過程并減少實(shí)驗(yàn)動物骨髓、外周血及鼻腔灌洗液中EOS數(shù)量。③可抑制變應(yīng)性鼻炎動物模型中EOS的發(fā)育、遷移及浸潤過程，減少EOS脫顆粒作用而減輕變應(yīng)性鼻炎的炎癥反應(yīng)[5，6，14]。由此可見，盡管目前AR發(fā)病機(jī)制研究尚未完全透徹，但Eotaxin-CCR3通路的激活以及CCR3基因的表達(dá)是AR發(fā)生與發(fā)展的重要因素。因此，CCR3可能是研究呼吸道過敏性疾病治療靶基因。單克隆抗體（mAb）是繼疫苗及重組蛋白后的一類最重要生物制劑，已成功應(yīng)用于一些自身免疫性疾病、腫瘤及過敏性疾病等的治療中[15]。運(yùn)用CCR3 mAb可阻斷CCR3-Eotaxin軸，達(dá)到緩解過敏相關(guān)疾病目的，且CCR3是Eotaxin在EOS表面的唯一受體，所以Eotaxin突變體拮抗CCR3的作用是很強(qiáng)的，而且特異性也很高[16]。有研究表明，CCR3缺陷小鼠，其EOS在內(nèi)皮下被滯留，也就失去了遷移至炎癥區(qū)域的能力[17]。變應(yīng)性哮喘（Allergic asthma）也是呼吸道過敏性疾病中的一種，哮喘的發(fā)生與發(fā)展與變應(yīng)性鼻炎相似，也是與肥大細(xì)胞、EOS等炎癥細(xì)胞及其表面的CCR3密切相關(guān)。有很多研究表明，在哮喘動物模型（主要是小鼠）中，以CCR3 mAb經(jīng)腹腔注射進(jìn)行干預(yù)，在臨床表現(xiàn)及炎癥細(xì)胞、炎癥因子及炎癥介質(zhì)等方面均有明顯改善，能夠明顯緩解動物模型打噴嚏、點(diǎn)頭呼吸、呼吸急促、哮鳴音、腹肌收縮及煩躁等典型發(fā)作癥狀；且能明顯抑制氣道肥大細(xì)胞、EOS等的募集、黏液分泌過多，以及各種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放[18-21]。因此，CCR3 mAb的運(yùn)用（經(jīng)腹腔注射）可明顯改善變應(yīng)性哮喘小鼠臨床癥狀、降低變應(yīng)性哮喘各項(xiàng)生化指標(biāo)，基于“統(tǒng)一氣道疾病”的理論，使用CCR3 mAb對AR是否有同樣影響，相關(guān)研究目前尚不多見，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CCR3 mAb治療小鼠AR，以觀察其產(chǎn)生的作用及其探討相關(guān)作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)在建立變應(yīng)性鼻炎小鼠模型的基礎(chǔ)上，通過使用CCR3 mAb經(jīng)腹腔注射（IP）及鼻腔滴入（ND）兩種途徑運(yùn)用于動物模型，觀察小鼠動物模型的臨床表現(xiàn)（抓鼻、打噴嚏、點(diǎn)頭呼吸、呼吸急促、哮鳴音、腹肌收縮、煩躁等），IP及ND組都較實(shí)驗(yàn)組（AR）明顯減輕，HE染色顯示鼻黏膜組織的炎癥浸潤情況較AR組也明顯好轉(zhuǎn)，鼻黏膜的組織形態(tài)學(xué)明顯改善。而ELIAS檢測IP及ND組鼻黏膜組織中的各項(xiàng)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)（組胺、IL-2、NF-α、IL-4、IL-10及IgE）的濃度均較AR組為低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；從行為學(xué)、臨床表現(xiàn)及炎癥水平的嚴(yán)重程度分析結(jié)果的總體趨勢為：AR組＞ND組≥IP組＞Normal組。可見CCR3 mAb經(jīng)腹腔注射較鼻腔滴入有更明顯的效果，可能由于經(jīng)鼻腔滴入后，由于有纖毛清除系統(tǒng)的存在，將一部分的抗體經(jīng)纖毛排除，對CCR3mAb的吸收不充分；另一方面經(jīng)腹腔注射后最終還是由腹腔血管吸收進(jìn)入血液，發(fā)揮拮抗CCR3的作用，因此經(jīng)腹腔注射后吸收更加充分。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用CCR3 mAb作用于變應(yīng)性鼻炎中，初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCR3 mAb可控制變應(yīng)性鼻炎的臨床癥狀，并可通過抑制炎性因子的作用而影響AR的發(fā)病機(jī)制。本研究僅在動物實(shí)驗(yàn)方面做了初步有意義的探討，CCR3 mAb在變應(yīng)性鼻炎中的作用及機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。