封雪 王詠強 趙濱濱

胃癌發(fā)病率和死亡率分別高居全球惡性腫瘤排行榜第四位和第二位，已成為一種全球性重大健康問題[1]。隨著胃癌綜合診斷和治療手段不斷進展，胃癌患者預后得到改善，但由于胃癌細胞的異常存活和惡性遷移、侵襲，胃癌患者的長期生存率仍較低[2]。手術(shù)是臨床胃癌治療重要手段之一，研究顯示圍手術(shù)期麻醉藥的應用可能影響腫瘤細胞和免疫細胞的行為，與癌癥的不良結(jié)局有關[3]。七氟醚是臨床常用麻醉藥之一，具有用藥劑量小、對血液動力學影響輕微、蘇醒快等優(yōu)勢。最近研究表明，七氟醚通過調(diào)節(jié)微小RNA(miRNA)表達對結(jié)直腸癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲具有顯著抑制作用[4-6]。miR-4458是一種乳腺癌、非小細胞肺癌抑癌基因，上調(diào)miR-4458表達對癌細胞的增殖、遷移和侵襲有顯著抑制作用[7,8]。異丙酚對肝癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用亦與上調(diào)miR-4458表達有關[9]。但miR-4458在胃癌中的作用、七氟醚是否調(diào)控miR-4458表達發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究重點探討了七氟醚對胃癌細胞SNU-1增殖和凋亡的影響，并探討其機制是否與調(diào)控miR-4458表達有關。

1 材料與方法

1.1 材料 SNU-1細胞、GES細胞購于武漢普諾賽生命科技公司；七氟醚購于上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；miRNA模擬物(mimics)、抑制物(anti-miRNA)購于北京華大基因公司；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium)MTT試劑盒、總RNA提取試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶生物公司；Transwell小室購于美國密理博公司；兔源β-actin(β-肌動蛋白)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、機制金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9抗體等一抗以及羊抗兔IgG二抗購于美國CST公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA定量PCR試劑盒購于美國GeneCopoeia公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：SNU-1細胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照1∶4比例進行傳代培養(yǎng)，換液頻率為每周2～3次，選取第3次對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。將細胞培養(yǎng)板置于密閉培養(yǎng)箱中，進氣口、出氣口分別連接麻醉氣體揮發(fā)罐(5% CO2、21% O2、74% N2)、氣體分析儀。將混合氣體瓶連接麻醉機，打開混合氣體瓶預充氣3 min，隨后調(diào)整氣流為0.5 L/min。隨后打開麻醉揮發(fā)罐，維持適當麻醉氣體濃度，37℃處理6 h，取出平板常規(guī)培養(yǎng)24 h[10]，隨后測定細胞活力、遷移和凋亡情況。

1.2.2 實驗分組：將SNU-1細胞分為正常對照(NC)組：進充入混合氣體；1.7%給藥組：七氟醚濃度為1.7%；3.4%給藥組：七氟醚濃度為3.4%；5.1%給藥組：七氟醚濃度為5.1%。為證實miR-4458對SNU-1細胞生物學行為的影響，利用脂質(zhì)體法將miR-NC、miR-4458 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4458瞬時轉(zhuǎn)染至SNU-1，依次記為miR-NC組、miR-4458 mimics組、anti-miR-NC組、anti-miR-4458組，收集轉(zhuǎn)染48 h細胞進行后續(xù)分析。為證實七氟醚是通過調(diào)控miR-4458表達進而影響SNU-1細胞生物學行為，對轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-4458的SNU-1細胞(轉(zhuǎn)染48 h)進行七氟醚處理6 h，依次記為5.1%給藥+anti-miR-NC組、5.1%給藥+anti-miR-4458組，常規(guī)培養(yǎng)24 h進行后續(xù)分析。人正常胃黏膜細胞(GES1)組：正常培養(yǎng)的GES1細胞；GES1(5.1%給藥組)：七氟醚濃度為5.1%。

1.2.3 MTT法檢測細胞活力:將各組SNU-1細胞接種到96孔板上，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl的MTT溶液在37℃下孵育4 h。之后，棄去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入150 μl的二甲基亞砜以溶解晶體。酶標儀測量570 nm波長的吸光度(A)來確定細胞活力。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:Annexin V結(jié)合緩沖液重懸各組細胞，向100 μl細胞懸液中加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI暗室孵育15 min。流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移:將各組細胞重懸在不含胎牛血清的培養(yǎng)液中，分別200 μl加入Transwell上室中，而下室中加入500 μl含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃下孵育12 h后，用無菌棉擦去上室內(nèi)未遷移細胞，4%多聚甲醛固定Transwell膜下表面遷移細胞10 min，室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色10 min。顯微鏡下隨機選擇3個視野進行細胞計數(shù)，以平均值表示細胞遷移數(shù)量。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達:放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液裂解各組細胞，BCA分析試劑盒測量蛋白濃度。100℃變性5 min，隨后取等量變性蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上后，將膜與5%脫脂牛奶室溫下孵育1 h，再將膜與特異性一抗(均1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。然后將膜與相應二抗室溫下孵育2 h。用增強型化學發(fā)光試劑盒檢測蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，目的蛋白和內(nèi)參β-actin灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

1.2.7 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-4458表達:總RNA提取試劑盒分別提取各組細胞總RNA，用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再采用miRNA qPCR試劑盒進行定量分析。2-ΔΔCt方法計算miR-4458表達量。miR-4458上游引物5’-AGAGGTAGGTGTGG

AAGAA-3’，下游引物5’-GCGAGCACAGAATTAATAC

GA C-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細胞活力、遷移細胞數(shù)顯著降低，而凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。七氟醚(5.1%)處理后GES1細胞活力、遷移細胞數(shù)、凋亡率無顯著變化。見圖1，表1。

圖1 不同濃度七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞凋亡的影響

表1 不同濃度七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響

2.2 不同濃度七氟醚對胃癌細胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表達的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 七氟醚對胃癌細胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

表2 七氟醚對胃癌細胞SNU-1中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

2.3 不同濃度七氟醚對miR-4458表達的影響 不同劑量七氟醚處理后SNU-1細胞中miR-4458表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 miR-4458對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響 與miR-NC組比較，miR-4458組SNU-1細胞miR-4458表達量顯著升高(P<0.05)，細胞活力、細胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白

表3 七氟醚對miR-4458表達的影響

表達量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。與anti-miR-4458組比較，anti-miR-4458組SNU-1細胞miR-4458表達量顯著降低(P<0.05)，細胞活力、細胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 miR-4458對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響

圖3 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表達

2.5 抑制miR-4458表達逆轉(zhuǎn)七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響 與5.1%給藥+anti-miR-NC組比較，5.1%給藥+anti-miR-4458組SNU-1細胞miR-4458表達量顯著降低(P<0.05)，細胞活力、細胞遷移數(shù)量、CyclinD1、MMP-2以及MMP-9蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表達

表5 anti-miR-4458逆轉(zhuǎn)七氟醚對胃癌細胞SNU-1細胞增殖、凋亡及遷移的影響

3 討論

癌細胞的異常遷移和侵襲在胃癌復發(fā)中具有重要作用。已有研究顯示麻醉藥的使用可影響癌癥患者的臨床結(jié)局。七氟醚是臨床常用吸入性麻醉劑，已被證實在肺癌、乳腺癌等多種實體腫瘤中具有抗增殖、抗轉(zhuǎn)移和促凋亡作用[11]。Yang等[12]研究顯示七氟醚可能通過抑制ERK信號通路參與結(jié)腸癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控抑癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導細胞凋亡和自噬。Kang等[13]報道七氟醚調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路以劑量依賴的方式抑制了卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。與上述研究類似，本研究中七氟醚處理后SNU-1細胞活力、侵襲數(shù)量顯著降低，而細胞凋亡率顯著增加，并呈劑量依賴效應。CyclinD1是細胞周期調(diào)控重要參與者，其通過促進周期向S期推進具有抗增殖作用，研究指出川芎嗪通過下調(diào)CyclinD1表達誘導G1期阻滯具有顯著的抗腫瘤作用[14]。MMP-2和MMP-9能夠消化細胞外基質(zhì)和基底膜從而提高腫瘤細胞的運動能力進而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、擴散，降低MMP-2和MMP-9表達量可有效胃癌細胞的遷移和侵襲[15]。本研究中七氟醚以劑量依賴方式降低CyclinD1、MMP-2以及MMP-9表達水平，與其抗增殖、抗遷移作用相吻合。此外，本研究發(fā)現(xiàn)七氟醚處理還可降低凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved-caspase-3表達水平。以上研究表明，七氟醚通過調(diào)控增殖、遷移和凋亡相關蛋白表達抑制胃癌細胞SNU-1增殖、遷移并誘導細胞凋亡。

miRNA通過與靶mRNA結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞多種生物學過程參與癌癥發(fā)生發(fā)展。研究表明miR-4458表達降低與肝癌患者預后差呈正相關[16]。血管瘤中過表達miR-4458顯著抑制細胞增殖、誘導細胞周期阻滯，而抑制miR-4458表達可逆轉(zhuǎn)G0/G1期阻滯和細胞凋亡[17]。此外，敲減Circ_0000337顯著促進miR-4458表達降低骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力從而抑制骨肉瘤進展[18]。本研究中轉(zhuǎn)染miR-4458 mimics發(fā)現(xiàn)，過表達miR-4458顯著降低SNU-1細胞活力和遷移能力，下調(diào)CyclinD1、MMP-2以及MMP-9表達，上調(diào)Cleaved-caspase-3，并促進細胞凋亡，而轉(zhuǎn)染anti-miR-4458抑制miR-4458表達則促進SNU-1細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡，這提示miR-4458在胃癌中具有抑癌作用。

近年來多項研究指出七氟醚通過調(diào)節(jié)miRNA表達對癌細胞發(fā)揮作用[17-20]。如七氟醚通過上調(diào)miR-124-3p表達抑制Rho相關的卷曲蛋白激酶(ROCK1)信號通路進而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[19]。結(jié)腸癌中七氟醚通過調(diào)節(jié)miR-203表達抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)/MMP-9通路抑制癌細胞遷移和侵襲[20]。本研究中七氟醚處理后SNU-1細胞中miR-4458表達呈以劑量依賴方式增加，提示七氟醚在胃癌中抗腫瘤作用與誘導miR-4458表達增加有關。深入研究顯示，抑制miR-4458表達還可逆轉(zhuǎn)七氟醚對SNU-1細胞增殖、遷移、凋亡以及相關蛋白表達的影響，恢復SNU-1細胞增殖、遷移能力以及凋亡水平。以上研究提示七氟醚通過上調(diào)SNU-1細胞中miR-4458水平發(fā)揮其抗增殖、抗侵襲和促凋亡作用。

綜上所述，本研究證實七氟醚通可抑制胃癌SNU-1細胞增殖和遷移，并誘導細胞凋亡，其機制與過上調(diào)miR-4458表達有關。這些發(fā)現(xiàn)有助于全面了解七氟醚的藥理作用，為胃癌患者選擇更合理的麻醉藥提供實驗依據(jù)。