楊慶華 楊隆良 楊曉莉

阿爾茨海默病(AD)是一種常見于老年人的復(fù)雜中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性退行性疾病，表現(xiàn)為記憶喪失、認知和行為功能的永久性損害以及各種精神障礙，是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因。隨著全球人口老齡化發(fā)展，AD發(fā)病率逐年增加，已成為一種普遍的健康問題[1]。由于對AD發(fā)生、進展機制認識有限，目前臨床仍缺乏有效方法來阻止或延緩疾病進展。長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為表達遺傳調(diào)控分子通過染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種方式發(fā)揮生物活性，參與調(diào)控細胞存活、凋亡、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等多種病理生理過程，在包括AD在內(nèi)的等多種神經(jīng)退行性疾病發(fā)揮作用[2,3]。研究顯示lncRNA Gm4419在糖尿病腎病中表達上調(diào)，敲低其表達可抑制炎性反應(yīng)[4]。Gm4419通過激活NF-κB信號上調(diào)趨化素表達誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡進而促進高血壓性腦動脈硬化惡化[5]。然而Gm4419在AD進展中的作用和分子機制并不清楚。miR-703是一種心肌梗死保護性miRNA，研究顯示miR-703通過抑制心肌細胞焦亡保護缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞損傷[6]。序列分析發(fā)現(xiàn)miR-703是Gm4419的潛在靶基因，但Gm4419是否靶向miR-703參與AD進展尚未有研究。β-淀粉樣肽25-35(Aβ25-35)是一種短分子片段，具有全長肽的毒性，其誘導(dǎo)的PC12細胞損傷在AD體外研究中已廣泛應(yīng)用[7,8]。因此，本研究重點探討Gm4419和miR-703對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響，分析二者靶向調(diào)控關(guān)系，以期為防治AD提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12購于中國科學(xué)院上海細胞庫；Aβ25-35(取適量Aβ25-35溶于無菌三蒸水中制成1 mmol/L儲存液，-20℃冰箱避光保存?zhèn)溆?購于上海樊克生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR green master mix購于大連寶生物公司；小干擾RNA(si-RNA)、miRNA模擬物(mimics)、miRNA抑制物(anti-miR)、過表達載體(pcDNA-RNA)由廣州復(fù)能基因公司提供；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購于北京博奧森生物；兔源B細胞淋巴瘤(Bcl-2)抗體、兔源Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購于上海碧云天生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒、丙二醛(MDA)含量測定試劑盒購于北京索萊寶生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):復(fù)蘇PC12細胞后，將其接種在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換1次培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。實驗前1 d用含50 μg/L的神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)PC12分化使其具有神經(jīng)細胞特性。

1.2.2 實驗分組:對照組(Con組)為未經(jīng)任何處理的PC12細胞；Aβ25-35組為用含40 μmol/L培養(yǎng)液孵育PC12細胞48 h[9]；Aβ25-35+si-NC組、Aβ25-35+si-Gm4419組、Aβ25-35+miR-NC組、Aβ25-35+miR-703組為將si-NC、si-Gm4419、miR-NC、miR-703 mimics分別轉(zhuǎn)染PC12細胞后，用含40 μmol/L Aβ25-35培養(yǎng)液孵育細胞48 h；Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-NC組、Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-703組為將si-Gm4419+anti-miR-NC、si-Gm4419+anti-miR-703分別轉(zhuǎn)染PC12細胞后，用含40 μmol/L Aβ25-35培養(yǎng)液孵育細胞48 h。細胞轉(zhuǎn)染為采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000進行瞬時轉(zhuǎn)染，收集轉(zhuǎn)染48 h細胞進行Aβ25-35處理。

1.2.3 實時定量PCR(RT-qPCR)分析Gm4419和miR-703表達量:按照Trizol試劑使用說明書提取各組PC12細胞總RNA，分光光度計法測定其濃度后置于-80℃冰箱保存。利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用SYBR green master mix進行RT-qPCR。Gm4419和miR-703表達量以2-ΔΔCT法計算。Gm4419上游引物5’-GGAACCA AGCAGACCGAAGAC-3’，下游引物5’-CCC CAACCCACAGGAACATAA-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物5’-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’，下游引物5’-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3’。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:收獲各組PC12細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸于500 μl結(jié)合緩沖液中，分別加入加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻后暗室孵育15 min，流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.2.5 蛋白質(zhì)印記法(western blot)檢測Bcl-2和Bax蛋白表達量:放射免疫沉淀試驗(RIPA)緩沖液提取各組PC12細胞總蛋白。蛋白定量后，將適量蛋白與等體積上樣緩沖液混合煮沸3 min變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。膜封閉后，4℃下用抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體孵育膜過夜。室溫下再用二抗孵育膜2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影、定影，曝光后，采用Image J軟件分析各條帶灰度值，目的蛋白表達量以對應(yīng)蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示。

1.2.6 ELISA試劑盒檢測SOD活性、MDA含量:收集各組PC12細胞至離心管內(nèi)，離心(1 000 g)10 min棄上清液，加入提取液超聲破碎細胞，4℃下離心(8 000 g)10 min獲得上清液，置于冰上備用。隨后按照試劑盒步驟測定SOD活性以及MDA含量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將含有miR-703結(jié)合位點序列的Gm4419野生序列或Gm4419突變序列分別克隆到熒光素酶報告質(zhì)粒構(gòu)建野生型或突變型熒光素酶報告載體WT-Gm4419或MUT-Gm4419。將WT-Gm4419、MUT-Gm4419分別與miR-703 mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染PC12細胞，在轉(zhuǎn)染48 h時裂解細胞并檢測熒光素酶活性。同時將pcDNA、pcDNA-Gm4419、si-NC、si-Gm4419分別轉(zhuǎn)染PC12細胞，RT-qPCR檢測細胞中miR-703表達量。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA Gm4419和miR-703在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷中的表達 Aβ25-35組PC12細胞Gm4419表達量顯著高于Con組(P<0.05)，miR-703表達量顯著低于Con組(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA Gm4419和miR-703在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷中的表達

2.2 抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響 與Con組比較，Aβ25-35組PC12細胞Gm4419表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與Aβ25-35+si-NC組比較，Aβ25-35+si-Gm4419組PC12細胞Gm4419表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性、Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的影響;A 凋亡相關(guān)蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表2 抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響

2.3 miR-703過表達對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響 與Aβ25-35+miR-NC組比較，Aβ25-35+miR-703組PC12細胞miR-703表達量、SOD活性、Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 miR-703過表達對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響;A 凋亡相關(guān)蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表3 miR-703過表達對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的影響

2.4 lncRNA Gm4419靶向調(diào)控miR-703的表達 LncBase Predicted v.2在線分析顯示Gm4419與miR-703存在特異性結(jié)合位點。miR-703 mimics和WT-Gm4419共轉(zhuǎn)染后細胞熒光素酶活性較miR-NC和WT-Gm4419共轉(zhuǎn)染顯著降低(P<0.05)，而miR-703 mimics和MUT-Gm4419共轉(zhuǎn)染后細胞熒光素酶活性與miR-NC和MUT-Gm4419共轉(zhuǎn)染比較無顯著變化。pcDNA-Gm4419組細胞中miR-703表達量較pcDNA組顯著降低(P<0.05)，而si-Gm4419組細胞中miR-703表達量較si-NC組顯著升高(P<0.05)。見表4、5，圖3。

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 抑制miR-703表達逆轉(zhuǎn)了lncRNA Gm4419抑制

表5 lncRNA Gm4419調(diào)控miR-703的表達

圖3 lncRNA Gm4419的序列中含有與miR-703互補的核苷酸序列

對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的作用 與Aβ25-35+si-Gm4419+anti-miR-NC組比較，Aβ25-35+si-Gm4419+ anti-miR-703組PC12細胞miR-703表達量、SOD活性、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，凋亡率、Bax蛋白表達量、MDA含量顯著升高(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 干擾miR-703表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡的作用

圖4 干擾miR-703表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA Gm4419表達對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的作用；A 凋亡相關(guān)蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

3 討論

AD可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和大腦認知能力退化，是老年癡呆癥發(fā)生的最主要原因。近年來。多項研究證實lncRNA參與了AD相關(guān)病理過程。如lncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)在Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元細胞中表達增加，下調(diào)其表達減弱Aβ25-35對細胞活力的抑制作用，并促進神經(jīng)元凋亡、增加Tau蛋白磷酸化水平[10]。上調(diào)lncRNA母系表達基因3(MEG3)可改善AD大鼠認知障礙，減輕神經(jīng)損傷，抑制星形膠質(zhì)細胞的激活和炎性反應(yīng)[11]。本研究中Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12損傷后Gm4419表達水平升高提示Gm4419表達改變可能與AD患者神經(jīng)元損傷。轉(zhuǎn)染si-Gm4419進行功能驗證發(fā)現(xiàn)，抑制Gm4419表達顯著減弱Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。與本研究發(fā)現(xiàn)類似，抑制Gm4419表達可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的肝或心肌細胞凋亡保護肝或心肌缺血再灌注損傷[12,13]。Bcl-2和Bax蛋白是線粒體凋亡途徑的作用調(diào)節(jié)因子，Bax移位導(dǎo)致線粒體通透性增加促進細胞色素c等蛋白釋放進而啟動caspase依賴性凋亡發(fā)生，Bcl-2通過與Bax結(jié)合具有抗凋亡作用[14]。本研究中抑制Gm4419表達顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞中Bax蛋白水平，升高Bcl-2表達水平，與其抗凋亡作用一致。氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的始動因素，其可促進Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化以及隨后突觸和神經(jīng)元的丟失，直接參與AD發(fā)生和進展[15]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，通過檢測細胞中MDA水平可有效反應(yīng)細胞氧化損傷程度[16]。本研究中發(fā)現(xiàn)抑制Gm4419表達顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞中MDA含量，并提高SOD活性。以上研究提示抑制Gm4419表表達可減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。

大量研究表明lncRNA通過與miRNA相互作用抑制miRNA活性是其發(fā)揮生物學(xué)功能的重要機制。如沉默lncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)通過上調(diào)miR-15a表達可改善AD小鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力，改善病理損傷，增強海馬神經(jīng)元抗氧化能力，抑制神經(jīng)元凋亡[17]。lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)通過靶向miR-125b顯著抑制神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)炎癥，刺激神經(jīng)突生長[18]。本研究發(fā)現(xiàn)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12損傷后miR-703表達降低，進一步研究證實miR-703是Gm4419的靶基因，且過表達或抑制Gm4419分別下調(diào)或上調(diào)miR-703表達水平。轉(zhuǎn)染miR-703進行功能分析發(fā)現(xiàn)過表達miR-703顯著抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，與抑制Gm4419表達的保護作用一致。進一步恢復(fù)實驗顯示，抑制miR-703表達顯著減弱Gm4419抑制對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞和氧化應(yīng)激損傷的保護作用，這進一步說明Gm4419可能通過靶向負調(diào)控miR-703表達參與Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞損傷。但本研究仍限于體外研究，后續(xù)將在動物模型中進一步確定lncRNA Gm4419/miR-703分子軸在Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞損傷中的作用。

總之，本研究證實抑制lncRNA Gm4419通過上調(diào)miR-703表達能夠減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，這為靶向lncRNA Gm4419/miR-703分子軸防治AD奠定理論基礎(chǔ)。