王焱 楊令芝 仰大貴 蘇先旭 蔣鑫

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種惡性漿細(xì)胞病，以M蛋白過度生成以及溶骨改變?yōu)樘卣?，MM在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中約占10%[1]。由于M蛋白過度生成，50%左右的MM患者在初次確診時(shí)即出現(xiàn)肌酐清除率下降，部分腎損傷嚴(yán)重的MM患者甚至需要進(jìn)行血液透析[2]。人體中免疫球蛋白輕鏈合成速度較重鏈合成速度高，過量輕鏈則由漿細(xì)胞中移出進(jìn)入血液成為游離輕鏈，因此正常人體中血液及尿液游離輕鏈維持在一定水平,MM患者分泌的M蛋白，導(dǎo)致過量輕鏈κ鏈或λ由惡性漿細(xì)胞中排除至患者血液，因而血清游離輕鏈水平的對(duì)MM的診斷、治療療效評(píng)估、患者預(yù)后具有重要的意義[3]。然而，有研究表明血液及尿液游離輕鏈水平與腎小管損傷、重吸收能力以及腎功能受損相關(guān)，患者腎臟功能的改變可導(dǎo)致其血液、尿液游離輕鏈水平發(fā)生改變[4]，因此對(duì)于漿細(xì)胞反應(yīng)性升高合并腎功能不全患者，血液及尿液游離輕鏈水平檢測(cè)難以提供較為準(zhǔn)確的診斷結(jié)果。與MM患者相比，正常漿細(xì)胞的免疫表型與單克隆細(xì)胞存在明顯區(qū)別，因而多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)已成為檢測(cè)包括MM在內(nèi)的血液系統(tǒng)腫瘤免疫表型的重要檢測(cè)手段[5]。然而，由于骨髓樣本的采集、貯存、處理，以及漿細(xì)胞在骨髓分布可能存在局灶性，檢測(cè)過程中對(duì)漿細(xì)胞存在可能的選擇性丟失[6]，造成多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)亦存在一定的缺陷。鑒于此，本研究旨在探討血清、尿液輕鏈κ、λ檢測(cè)聯(lián)合多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)初診MM合并腎功能不全患者的診斷價(jià)值，為臨床提供一定的理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選在2019年1月至2020年12月都江堰市人民醫(yī)院進(jìn)行血清、尿液輕鏈κ、λ及骨髓多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的151例漿細(xì)胞增高合并腎功能不全的患者作為研究對(duì)象，其中男90例，女61例；年齡33～84歲，平均年齡(62.18±16.55)歲。以病理活檢及《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2015年修訂)》中MM診斷依據(jù)為金標(biāo)準(zhǔn)[8]，MM分期參考修訂的國(guó)際分期體系(international staging system，ISS)[9]。151例患者中，94例診斷為MM，其中男56例，女38例；平均年齡(60.29±15.24)歲；ISS分期Ⅰ期32例，Ⅱ期39例，Ⅲ期23例。非MM組患者中，男34例，女23例；平均年齡(58.81±17.16)歲。2組患者性別比、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初診患者；(2)腎功能不全診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《KDIGO慢性腎臟病評(píng)價(jià)及管理臨床實(shí)踐指南》[7]；(3)腎功能檢測(cè)結(jié)果及臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并血液系統(tǒng)疾病患者；(2)合并其他惡性腫瘤患者；(3)已在外院接受過治療的患者。本項(xiàng)研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查，所使用的臨床試驗(yàn)樣本可知情同意豁免。

1.3 方法 取入組患者清晨空腹中段尿液5 ml，1 500 r離心5 min，取上清部分；取入組患者清晨空腹外周血5 ml，靜置20 min，4 000 r離心10 min，分離血清；免疫比濁法測(cè)定患者血清、尿液中輕鏈κ、λ水平，試劑盒購(gòu)自貝克曼公司，檢測(cè)儀器為IMMAGE 800特定蛋白分析儀(美國(guó)貝克曼公司)；采用Cobas c501全自動(dòng)生化儀(瑞士羅氏公司)檢測(cè)患者血清中尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(serum creatinine，SCr)、β2 微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)水平；行骨髓穿刺，抽取患者2 ml骨髓，置入肝素抗凝管中，常規(guī)方法對(duì)細(xì)胞表面及胞內(nèi)抗原進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞管中加入50 μl骨髓血及2 μl熒光標(biāo)記抗體(CD38、CD138、CD19、CD56)，孵育，加入氯化銨溶血?jiǎng)?，避光混勻，?jīng)洗滌，離心，棄除上清，重懸等程序后，CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司)檢測(cè)，CD45/SSC 設(shè)門，檢測(cè)細(xì)胞熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分比，超過20%定義為陽(yáng)性，檢測(cè)患者漿細(xì)胞所占百分比，CD38、CD138、CD19、CD56陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 2組患者血清、尿液檢測(cè)指標(biāo)比較 MM組患者血清及尿液中κ、λ水平高于非MM組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組患者血清中BUN、SCr、β2-MG水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者血清、尿液檢測(cè)指標(biāo)比較

2.2 2組患者多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)指標(biāo)比較 MM組患者漿細(xì)胞比例、CD56陽(yáng)性率高于非MM組患者，MM組患者CD19陽(yáng)性率低于非MM組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組患者CD38陽(yáng)性率、CD138陽(yáng)性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)對(duì)MM的診斷效能分析 繪制單項(xiàng)診斷MM的ROC曲線，單項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)中，AUC>0.7且約登指數(shù)>0.5的有漿細(xì)胞比例、血清κ、血清λ水平。見表3，圖1。

2.4 指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MM的診斷效能分析 漿細(xì)胞比例、血清κ水平、血清λ水平將單項(xiàng)指標(biāo)中AUC>0.7且約登指數(shù)>0.5，經(jīng)二元Logistic回歸分析，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷的Logistic回歸模型為：In[P/(1-P)]=0.190×漿細(xì)胞比例+0.014×血清κ+0.013×血清λ

表2 2組患者多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)指標(biāo)比較 %

表3 單項(xiàng)指標(biāo)的診斷效能分析

圖1 單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)診斷MM的ROC曲線

-8.969，對(duì)每個(gè)指標(biāo)的P值進(jìn)行計(jì)算取得預(yù)測(cè)概率，隨后繪制ROC曲線，3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷MM的AUC為0.896，高于3項(xiàng)指標(biāo)中兩兩聯(lián)合檢測(cè)(Z=3.367、4.152、2.761，均P<0.05)。見圖2，表4、5。

圖2 指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)診斷MM的ROC曲線

表4 單項(xiàng)指標(biāo)的Logistic回歸分析結(jié)果

表5 指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能分析

3 討論

在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，MM發(fā)病率約占第二位，我國(guó)MM發(fā)病以中老年人群為主，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[10]。MM由于M蛋白引發(fā)的管型腎病，輕鏈淀粉樣變性、單克隆免疫球蛋白沉積病導(dǎo)致患者出現(xiàn)腎臟損傷，MM引發(fā)的腎損傷可出現(xiàn)血清肌酐上升、蛋白尿、腎小管病變，臨床可以慢性腎病、急性腎損傷為表現(xiàn)，MM患者腎損傷的發(fā)病率約為50%[11]。骨髓活檢是鑒別MM的重要手段，然而由于骨髓瘤細(xì)胞的灶狀分布、骨髓樣本的稀釋，致其診斷敏感性降低。在臨床實(shí)踐過程中，由于骨髓穿刺中的部位選擇不當(dāng)、重復(fù)抽吸、抽吸后骨髓液的稀釋等原因?qū)е麓┐淌?，骨髓推片受染色時(shí)間、溫度及推片力度等因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變化不明顯[12]，在風(fēng)濕性疾病，結(jié)核分枝桿菌感染，肝臟疾病，病毒感染等患者中，骨髓漿細(xì)胞比例亦呈增高趨勢(shì)[13]，上述種種因素，造成MM的漏診及誤診，因此單純依靠骨髓活檢手段難以對(duì)MM確診。

既往認(rèn)為血清游離輕鏈?zhǔn)禽p鏈分泌型MM的標(biāo)志物，然而現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)部分MM患者不僅具有產(chǎn)生完整免疫球蛋白的漿細(xì)胞，部分異常漿細(xì)胞亦可產(chǎn)生游離輕鏈[14]，此外部分患者復(fù)發(fā)時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化產(chǎn)生游離輕鏈的漿細(xì)胞占據(jù)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致血清和尿液游離輕鏈增高[15]。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在漿細(xì)胞增高的腎功能不全患者中，MM組患者與非MM組患者血清中BUN、SCr、β2-MG水平比較并無明顯差異，提示對(duì)于合并腎功能不全的漿細(xì)胞增高患者，單純通過腎功能指標(biāo)鑒別診斷MM并無優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MM組患者血清及尿液中κ水平、λ水平高于非MM組患者，與既有研究相似[16]。然而，在腎臟發(fā)生病變、免疫性疾病導(dǎo)致腎小管功能受損，腎小管重吸收功能降低時(shí)，血清及尿液中游離輕鏈水平也發(fā)生異常[17]。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，盡管血清及尿液中κ水平、λ水平AUC較高，但是上述指標(biāo)的敏感性、特異性并不強(qiáng)。進(jìn)一步對(duì)患者骨髓樣本采用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MM組患者漿細(xì)胞比例高于非MM組患者，其免疫表型檢測(cè)的結(jié)果CD56、CD19、CD138、CD38陽(yáng)性率亦與既往研究相似[18]。而在單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)中，漿細(xì)胞比例AUC為0.795，特異性為90.9%，但是敏感性較低。盡管多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在骨髓樣本細(xì)胞免疫表型，漿細(xì)胞比例鑒別中具有靈敏度高，快速的優(yōu)勢(shì)，但是在臨床實(shí)踐中，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)受MM病灶分布、樣本采集、處理及存放的影響，該檢測(cè)方式的結(jié)果仍存缺陷。

對(duì)漿細(xì)胞增高合并腎功能不全的患者，單一實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)難以對(duì)MM進(jìn)行鑒別診斷。本項(xiàng)研究聯(lián)合血清κ水平、λ水平、多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)指標(biāo)預(yù)測(cè)其對(duì)MM的診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞比例+血清κ水平+血清λ水平聯(lián)合診斷的效能最高(AUC=0.896，特異性=89.1%，約登指數(shù)=0.69)，提示在漿細(xì)胞增高合并腎功能不全的患者中，上述指標(biāo)能夠相互補(bǔ)充，盡管血清κ水平、λ水平在發(fā)生腎功能不全的患者中特異性及敏感性不強(qiáng)，但是對(duì)于輕鏈分泌型、存在輕鏈逃逸的MM患者，其具有較強(qiáng)的敏感性及特異性。多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)能夠?qū)撬杓?xì)胞中的多種抗原進(jìn)行分析，對(duì)MM患者骨髓瘤細(xì)胞的多種特征具有較高的識(shí)別作用，同時(shí)對(duì)抗原表達(dá)水平具有定量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)[19]。本研究亦發(fā)現(xiàn)將漿細(xì)胞比例、血清κ水平、血清λ水平聯(lián)合，其AUC較三者中任意兩兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)較高，提示漿細(xì)胞比例、血清κ水平、血清λ水平可避免多參數(shù)流式細(xì)胞在骨髓樣本采集、儲(chǔ)存、處理中多種因素的影響，克服血清κ水平、血清λ水平在腎功能不全患者中特異性及敏感性不強(qiáng)的劣勢(shì)，可快速、準(zhǔn)確的對(duì)漿細(xì)胞增高合并腎功能不全患者中MM的發(fā)生情況進(jìn)行鑒別診斷。

綜上所述，漿細(xì)胞比例、血清κ水平、血清λ水平可作為MM的輔助診斷措施，還需擴(kuò)大樣本含量，提高骨髓穿刺及取樣的成功率，此外本研究的不足之處是缺乏經(jīng)治療后出現(xiàn)輕鏈逃逸的MM患者，對(duì)上述指標(biāo)在鑒別診斷及預(yù)測(cè)患者預(yù)后的研究仍需深入探討。