梁瑞華，吳 娜，陳紅霞，任 平

(湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100)

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，患者確診時往往已處于晚期，因此，大多數(shù)治療方案效果不佳，預后差，其5年生存率低至2%[1-2]。目前已有許多文獻[3-5]報道胰腺癌患者對一線化療藥物吉西他濱耐藥，因此，尋求新的用于治療胰腺癌的藥物非常必要。千金藤素(cepharanthine，CEP)是一種從防己科千金藤屬植物千金藤中提取的活性成分，屬于異喹啉類生物堿，具有抗瘧疾、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等藥理功能[6]。有研究[7-8]表明CEP能夠抑制結(jié)直腸癌、黑色素瘤、肺癌等腫瘤細胞的增殖，但是，關于CEP對胰腺癌作用的研究報道很少。我們主要探討CEP對胰腺癌AsPC-1細胞的作用，為CEP治療胰腺癌提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌AsPC-1細胞株由華中科技大學實驗室贈送；CEP購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度>98%;DMSO購自Sigma;胎牛血清購自BI;RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；雙抗購自Gibco；MTT購于上海碧云天生物科技公司;PARP、caspase-3、cleaved-caspase-3、cleaved-casepase-9和β-actin抗體購自萬類生物科技公司；ECL發(fā)光劑購自大連美侖生物技術公司；凋亡試劑盒、臺盼藍染液購自上海碧云天生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

胰腺癌細胞AsPC-1培養(yǎng)于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2d傳1次代。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力

取對數(shù)生長期的AsPC-1細胞調(diào)整細胞懸液濃度，以每孔8 000個細胞接種于96孔板中，當細胞生長融合至70%～80%時，各組中加入100μL不同濃度(0、2.187 5、4.375、8.75、17.5、35μmol/L)的CEP處理48h，對照組中加入100μL的培養(yǎng)基，每個濃度設置5個復孔，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，藥物作用結(jié)束后，加入10μL用PBS配置的MTT溶液，然后將培養(yǎng)板重新置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)作用，4h后用200μL槍輕輕棄去培養(yǎng)板中的上清，隨后每孔加入150μL DMSO，用酶標儀測定490nm波長處各孔的吸光度(OD)值，取平均值，計算給藥后的細胞存活率，實驗重復3次，求出3次給藥后細胞抑制率。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察

將胰腺癌AsPC-1、BxPC-3細胞分別接種到6孔板中，待細胞長到70%左右開始給藥。將AsPC-1細胞分為對照組、CEP低劑量(17.5μmol/L)組和CEP高劑量(35μmol/L)組。48h后，采用倒置顯微鏡20×觀察細胞形態(tài)的變化。

1.2.4 臺盼藍染色

取出六孔板，加入PBS洗一遍，加入胰酶對細胞進行消化，待細胞變圓后加入適量的PBS稀釋，并用槍吹打混勻。取適量臺盼藍染液對細胞進行避光染色，數(shù)分鐘后，吸取10μL經(jīng)過染色后的細胞，均勻打入計數(shù)池中，在光學顯微鏡下用細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，統(tǒng)計出藍色細胞和細胞總數(shù)。分別統(tǒng)計千金藤素對照組、千金藤素CEP低濃度組和千金藤素CEP高濃度組作用48h后細胞活力值：活細胞率(%)=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))%，實驗重復3次，并求出平均值。

1.2.5 細胞凋亡檢測

將AsPC-1細胞按1×106個/孔鋪于6孔板中37℃恒溫箱培養(yǎng)48h，分別用低劑量(17.5μmol/L)和高劑量(35μmol/L)的CEP作用AsPC-1細胞，48h后，取出6孔板至超凈臺，把細胞培養(yǎng)液吸出，并用PBS洗滌板中細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液消化細胞。細胞培養(yǎng)箱中孵育3min后輕輕吹打孔板，使細胞吹打下來，將其移至1.5mL離心管中，1 000g離心3min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)5～10萬細胞重懸，1 000g離心5min，棄上清，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液于離心管中，混勻，再加入10μL碘化丙啶(PI)染色液，混勻，室溫避光孵育15min，上機檢測。實驗重復3次。

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達水平

取對數(shù)生長期AsPC-1細胞以2×105接種于6孔板中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。對照組給予正常培養(yǎng)液，給藥組分為CEP低劑量(17.5μmol/L)組、高劑量(35μmol/L)組，48h后，取出培養(yǎng)板，收集細胞，提取總蛋白，用BCA法測定不同濃度給藥組的蛋白濃度，分別定量后，將蛋白樣品加入到配制好的丙烯酰胺凝膠泳道中電泳分離，然后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%的脫脂牛奶將膜室溫封閉90min，封閉完成后用TBST清洗膜3次，分別加入對應一抗PARP(1∶1 000)、caspase-3、cleaved-caspase-3(1∶1 000)、cleaved-caspase-9(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，然后加入對應羊抗兔二抗(1∶12 000)，室溫搖床孵育1h后，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，定影后進行條帶分析。實驗重復3次。

2 結(jié) 果

2.1 CEP對胰腺癌AsPC-1細胞增殖和活力的影響

采用MTT法檢測CEP對胰腺癌AsPC-1細胞活力的影響。不同濃度(0、2.187 5、4.375、8.75、17.5、35μmol/L)的CEP作用于AsPC-1細胞48h，隨著藥物濃度的增加，CEP對細胞活力的抑制逐漸增強(P<0.01)，見圖1，提示CEP作用于AsPC-1細胞后，細胞活力呈濃度依賴性被抑制。

與control組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3

2.2 細胞形態(tài)學觀察

藥物作用分別作用于胰腺癌AsPC-1細胞48h，加入PBS洗兩遍，再加入適量的PBS，倒置顯微鏡下觀察AsPC-1細胞的形態(tài)學變化，給藥組細胞脫落數(shù)目明顯增多，并且給藥劑量越高，細胞脫落數(shù)目越多，細胞皺縮變圓細胞所占比例也更多，如圖2(封二)所示。

2.3 AsPC-1細胞給藥48h后臺盼藍染液細胞活性的檢測結(jié)果

將AsPC-1細胞分別設置3個給藥濃度，AsPC-1細胞對照組、CEP低劑量組、CEP高劑量組，給藥48h后，用臺盼藍對給藥后細胞活性進行檢測，隨著劑量的增大，細胞存活率越來越低，其結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)果如圖3所示。

與對照組相比，**P<0.01，***P<0.001，n=3

2.4 細胞凋亡檢測結(jié)果

通過Annexin V-FITC和PI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組與低劑量和高劑量給藥組相比，AsPC-1細胞48h凋亡率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見圖4(封二)、圖5。

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，n=3

2.5 CEP對胰腺癌AsPC1細胞凋亡相關蛋白表達的影響

用Western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，在低劑量組和高劑量組CEP作用下，與對照組相比，凋亡相關性蛋白PARP、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖6、7。這說明CEP可誘導胰腺癌細胞AsPC-1細胞凋亡。

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，n=3

3 討 論

近年來胰腺癌發(fā)病率一直在不斷上升，其發(fā)病率和死亡率基本相同，靶向治療成為胰腺癌患者的選擇之一，但靶向藥物存在價格昂貴、不良反應嚴重等不足[9]。近年來采用全胰切除術，此方案使胰腺癌的生存期有所延長，但是治療周期較長，并且易轉(zhuǎn)移至肝臟[10-11]。用于胰腺癌治療的藥物主要以吉西他濱為主，但是胰腺癌細胞株很容易對吉西他濱產(chǎn)生耐藥，因此，研究用于治療胰腺癌的新藥是非常有意義的。

CEP是日本自20世紀50年代以來用于治療一些急慢性疾病的藥物，它是唯一批準用于人類的雙芐異喹啉類生物堿類藥物[12]。CEP具有多種醫(yī)用效果，并且有多種方式來抑制腫瘤。我們結(jié)果顯示不同濃度的CEP作用于人胰腺癌AsPC-1細胞，隨著藥物作用濃度增加，其細胞增值率和活性不斷降低，表明CEP對胰腺癌AsPC-1細胞具有抑制作用。有文獻[13-14]報道CEP通過巨噬細胞、T細胞、NK細胞等對腫瘤細胞產(chǎn)生抑制作用。癌細胞凋亡機制一直是抗癌研究的熱點，這一過程與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，這是在基因的調(diào)控下主動程序性死亡，其中最主要過程之一是線粒體凋亡。線粒體在相關的信號作用下，開放通透性轉(zhuǎn)換孔。離子的進出改變了膜的電位。線粒體膜的相關功能在此反應下喪失，引發(fā)導致細胞凋亡的caspase家族級聯(lián)反應。另外ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)不僅是修復DNA損傷相關的酶，而且還是caspase的切割底物。因此，caspase家族、PARP是檢測腫瘤凋亡的重要指標。

CEP可以抑制子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌細胞的生長并能夠促使這兩種細胞凋亡的發(fā)生[15-16]。CEP在Jurka和K562細胞系中能夠促使凋亡相關蛋caspase-9、caspase-3以及PARP的剪切[17]。但是目前尚未有很多有關CEP對胰腺癌抑制作用的報道?；谝陨?，CEP能否抑制胰腺癌細胞的增殖并且能夠促使其凋亡具有重大意義。我們使用不同濃度的CEP作用于人胰腺癌AsPC-1細胞，MTT結(jié)果檢測發(fā)現(xiàn)隨著藥物作用濃度的增加，AsPC-1細胞的存活率不斷降低，通過細胞形態(tài)學觀察我們發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增大，細胞變大、皺縮程度所占比例不斷增多，劑量越大細胞變形程度也越明顯。臺盼藍染色發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量升高，細胞存活率逐漸降低。并且通過對Western blot實驗結(jié)果的分析我們發(fā)現(xiàn)，不同給藥組細胞凋亡相關蛋白PARP、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9相比于正常對照組表達量均有上調(diào)。流式凋亡結(jié)果顯示，給藥后AsPC-1細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均有所增加。

綜上所述，CEP有誘導胰腺癌細胞株凋亡的作用。但本實驗僅使用了一種人胰腺癌細胞株，關于CEP具體通過什么機制誘導AsPC-1細胞凋亡并未予以探討，并且CEP在體內(nèi)作用情況也有待于探究，存在很多不足之處，因此，在以后的實驗研究中將繼續(xù)進行研究。