劉 菲，李清潔，李世環(huán)，李敏才

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

血管鈣化(vascular calcification，VC)是鈣鹽、磷酸鹽等礦物質(zhì)沉積于血管壁的過程[1]，已經(jīng)成為動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓及慢性腎病等疾病發(fā)生率和死亡率增加的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。近年來的研究證實(shí)VC是主動的可調(diào)控的鈣鹽及磷酸鹽高度有序礦化，類似于骨發(fā)育生物學(xué)過程[3]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMCs)表型轉(zhuǎn)化是VC的重要現(xiàn)象，VSMCs蛋白合成增加，產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)，分泌骨相關(guān)蛋白，促進(jìn)VSMCs轉(zhuǎn)分化為骨樣細(xì)胞，從而導(dǎo)致血管鈣化。前期實(shí)驗(yàn)[4-6]已經(jīng)誘導(dǎo)VSMC表達(dá)成骨樣細(xì)胞表型，并闡明了micro-206可以抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化。

p53是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對細(xì)胞生長周期調(diào)控發(fā)揮重要作用。人體AS斑塊中p53表達(dá)上調(diào)，與血管壁細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)。Zheng等[7]報(bào)道p53介導(dǎo)腫瘤中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，Li等[8]報(bào)道p53介導(dǎo)心肌梗死中內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，參與纖維修復(fù)，Ubil等[9]報(bào)道心肌梗死后，增強(qiáng)的p53表達(dá)促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成上皮細(xì)胞。我們推測p53與VC中VSMC表型轉(zhuǎn)化調(diào)控密切相關(guān)，為此，我們建立小鼠動脈硬化模型，給予p53抑制劑/激動劑藥物，觀察其對血管鈣化的影響，期望對VC調(diào)控提供新的靶點(diǎn)和數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 動物

21只apoE-/-雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量約23g，購買于北京Charles river實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。動物合格證號：SYXK(鄂)2019-0031。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在21℃～27℃，濕度控制在50%～60%，維持晝夜節(jié)律。

1.2 試劑和儀器

油紅O染液(索萊寶公司)，蘇木素染液(索萊寶公司)，伊紅染液(索萊寶公司)，茜素紅染液(塞維爾公司)，體視顯微鏡(Mshot公司)。

1.3 方法

1.3.1 VC模型構(gòu)建

21只雄性6～8周齡apoE-/-小鼠，高脂飲食飼養(yǎng)12周后，將小鼠隨機(jī)分為3組，每組7只，對照組(Con組)、p53激動劑Parthenolide(Par組)、p53抑制劑Pifithrin/-u(PFT-u組)。Par組每只小鼠經(jīng)腹腔注射5mg/(kg·d)劑量[10]的Parthenolide，PFT-u組每只小鼠經(jīng)腹腔注射3mg/(kg·d)劑量[11]的Pifithrin/-u，繼續(xù)飼養(yǎng)4周，對小鼠胸主動脈、頸總動脈予以取材。

1.3.2 油紅O染色

取油紅O粉末0.5g，溶于100mL異丙醇，混勻，用濾紙過濾得油紅O儲備液，4℃避光保存。以儲備液∶超純水=3∶2比例配置油紅O溶液，混勻后，經(jīng)0.22μm過濾頭過濾，靜置10min。血管用60%異丙醇浸泡30min，放入油紅O溶液中漂染3h，60%異丙醇溶液洗至胸主動脈背景干凈。體視顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 茜素紅染色

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水化，將切片放入盛有茜素紅染液的染缸里5～10min進(jìn)行染色，然后用自來水沖洗，將切片放到烘箱內(nèi)將水分烤干，蓋玻片封片最后用顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.3.4 HE染色

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水化，將切片放入蘇木素染液中，染3～5min后用自來水沖洗約2min，1%鹽酸乙醇酸化15s，水洗約2min，0.6%氨水返藍(lán)1min，繼而水洗約4min，切片入伊紅染液中染色30s，水洗2min，脫水封片，顯微鏡鏡檢，采集圖像。

1.3.5 血管環(huán)功能測定

取材后，在體式顯微鏡下迅速將胸主動脈周圍的多余脂肪剝離，然后剪取一段長約3mm的血管環(huán)，繼用兩根25μm的鎢絲穿過血管環(huán)，將鎢絲分別固定于張力浴槽的兩端，且兩根鎢絲處于平行狀態(tài)，用Krebs-Henseniet洗兩次，每次15min，然后用氯化鉀溶液預(yù)收縮5min，加入U(xiǎn)46619收縮劑，穩(wěn)定后依次加入不同濃度的乙酰膽堿(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5)，各個(gè)濃度作用時(shí)間約為5min，平衡5～10min后，更換Krebs-Henseniet液2次，平衡后加入U(xiǎn)46619收縮劑，約45min穩(wěn)定后依次加入不同濃度的硝普鈉(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5)，作用時(shí)間約為5min。記錄數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 p53抑制劑減少主動脈血管粥樣硬化斑塊

如圖1A顯示，小鼠胸主動脈與腹主動脈部分組織染成紅色，表明均有斑塊形成。定量分析血管斑塊面積與血管總面積，如圖1B顯示，與Con組相比，PFT-u組斑塊面積/整體面積比值明顯降低(P<0.05)，Par組斑塊面積/整體面積比值顯著升高(P<0.05)；與Par組相比較，PFT-u組斑塊面積/整體面積比值顯著性下調(diào)(P<0.01)。表明p53抑制劑抑制動脈粥樣硬化形成，p53激動劑加重動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展。

A.主動脈大體油紅O染色；B.定量分析斑塊面積/整體面積比值(*P<0.05，**P<0.01，n=3)

2.2 p53抑制劑抑制動脈粥樣硬化斑塊形成

如圖2A(封三)結(jié)果顯示，小鼠頸總動脈管壁增厚、斑塊形成，管腔均有一定程度的狹窄。為檢查斑塊對血管狹窄程度的影響，以斑塊面積/血管腔面積比值進(jìn)行定量分析。與Con組相比，PFT-u組斑塊面積/血管腔面積比值降低，具有顯著性差異(P<0.05)；Par組斑塊面積/血管腔面積比值上調(diào)，沒有顯著性差異(P>0.05)。與Par組相比，PFT-u組斑塊面積/血管腔面積比值下調(diào)，具有極其顯著性差異(P<0.01)。結(jié)果表明p53抑制劑抑制動脈粥樣硬化斑塊形成，緩解斑塊造成的動脈血管狹窄。

2.3 p53抑制劑減弱動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜的增生

如圖3A(封三)染色結(jié)果顯示，Con組動脈血管壁斑塊處結(jié)構(gòu)紊亂，斑塊處內(nèi)膜增厚，內(nèi)彈力膜結(jié)構(gòu)比較模糊；Par組動脈血管壁斑塊處內(nèi)膜增厚嚴(yán)重，內(nèi)外彈力膜消失；PFT-u組動脈血管斑塊處內(nèi)膜增厚減弱，內(nèi)外彈力膜較為清晰、完整。為確定p53抑制劑對內(nèi)膜增厚的影響程度，以內(nèi)膜面積/血管總面積比值進(jìn)行定量分析，如圖3B所示：與Con組相比，PFT-u組血管內(nèi)膜面積/血管總面積比值降低，具有顯著性差異(P<0.05)；Par組血管內(nèi)膜面積/血管總面積比值升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與Par組相比，PFT-u組血管內(nèi)膜面積/血管總面積比值降低，具有極其顯著性差異(P<0.01)。結(jié)果表明，p53抑制劑減弱動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膜增生，緩解血管腔狹窄。

2.4 p53抑制劑改善主動脈血管功能

取apoE-/-小鼠主動脈血管環(huán)，先加入U(xiǎn)46619引起血管進(jìn)行收縮，待測定系統(tǒng)平衡后，加入不同濃度的乙酰膽堿和硝普鈉舒張血管，檢測并記錄血管舒張程度。結(jié)果如圖4A顯示，在乙酰膽堿作用下，與Con組相比，PFT-u組小鼠胸主動脈舒張功能升高，具有顯著性差異(P<0.05)；Par組小鼠胸主動脈舒張功能降低，無顯著性差異。與Par組相比，PFT-u組小鼠胸主動脈舒張性顯著升高(P<0.05)。在硝普鈉的作用下，結(jié)果如圖4B顯示：與Con組相比，PFT-u組小鼠胸主動脈舒張功能升高，無顯著性差異；Par組小鼠胸主動脈舒張功能降低，無顯著性差異；與Par組相比，PFT-u組小鼠胸主動脈舒張性顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明p53抑制劑能上調(diào)動脈粥樣硬化血管的舒張功能。

A.主動脈在乙酰膽堿作用下的舒張作用；B.主動脈在硝普鈉作用下的舒張作用(*P<0.05，n=3)

3 結(jié) 論

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)是世界上造成死亡和致殘的主要原因，它代表著全球性的健康問題，CVD的特征是一系列疾病，與多種危險(xiǎn)因素之間的復(fù)雜相互作用有關(guān)[12]。動脈粥樣硬化是引起心血管疾病死亡的主要原因，是以脂質(zhì)沉積和斑塊形成為主要特征的慢性進(jìn)行性血管炎癥[13]。血管鈣化是指血管細(xì)胞異位礦化[14]，是一個(gè)活躍而復(fù)雜的過程，涉及鈣在動脈壁中沉積的多種機(jī)制。研究VC發(fā)病機(jī)理及調(diào)控機(jī)制具有非常重要的臨床意義，我們建立動脈粥樣硬化模型，模擬VC病變過程，并研究其病變的形態(tài)學(xué)特征。

p53是經(jīng)典的腫瘤抑制基因，是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對誘導(dǎo)細(xì)胞生長周期抑制和凋亡發(fā)揮重要作用；同時(shí)p53是重要的應(yīng)激-反應(yīng)基因，參與細(xì)胞重新編排[15]。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)p53抑制劑減少動脈粥樣硬化斑塊面積、減少血管管腔狹窄、抑制動脈內(nèi)膜增生，改善胸主動脈血管功能。

Tataria等[16]發(fā)現(xiàn)p53基因可以結(jié)合到軟骨瘤osterix啟動子區(qū)域，對軟骨細(xì)胞分化標(biāo)志物之表達(dá)有重要調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)osterix、Cbf1a/Runx2、ALP等成骨細(xì)胞因子表達(dá)。已有研究表明[17]，VSMC在氧化應(yīng)激、炎癥和機(jī)械損傷等刺激下，向具有分泌功能細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分泌骨形成相關(guān)蛋白，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenic protein-2，BMP2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等蛋白，促進(jìn)鈣化形成。我們的研究結(jié)果符合這些研究現(xiàn)象，p53可以參與血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，抑制血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而抑制動脈粥樣硬化的斑塊形成，這為動脈血管硬化的治療又提供了一條新思路。