王 芳，劉星吟，王攀琦，劉 洋，劉復(fù)興，寧志豐**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌， 非小細(xì)胞肺癌又分為肺鱗癌和肺腺癌。肺癌的發(fā)病率在各類癌癥中位居第二，死亡率在所有類型的癌癥中遙遙領(lǐng)先[1]。目前，肺癌主要以化療和放療為主。但化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，且對(duì)患者傷害較大，因此，尋找新的抗腫瘤藥物成為治療肺癌的研究熱點(diǎn)。二甲雙胍是治療2型糖尿病的口服降糖藥，Evans等[2]首次發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以降低糖尿病患者的癌癥發(fā)病率，此后，二甲雙胍的抗癌作用受到廣泛關(guān)注。研究表明[3-4]，二甲雙胍對(duì)肺癌、子宮內(nèi)膜癌等均有抑制作用，具有潛在抗癌價(jià)值。硫利達(dá)嗪是一種常見的吩噻嗪類抗精神病藥物，近年來研究[5-6]發(fā)現(xiàn)硫利達(dá)嗪對(duì)多種癌癥如膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等有抑制作用。因此，我們將二甲雙胍與硫利達(dá)嗪作為新的抗腫瘤藥進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞H1975細(xì)胞株為研究模型。主要試劑：鹽酸硫利達(dá)嗪和鹽酸二甲雙胍、二甲基亞砜(DMS0)購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自碧云天生物技術(shù)研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國 Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素購自美國Gibico公司；Matrigel膠購自美國Corning公司；Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、mTOR、p-mTOR和β-actin抗體購自武漢愛博泰克(ABclonal)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞H1975細(xì)胞的培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。配制含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將消化后的H1975細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度至7×104個(gè)/mL，96孔板每孔加入100μL的細(xì)胞懸液，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)70%以上時(shí)給藥設(shè)硫利達(dá)嗪組(THZ)濃度為0、2.5、5、10、20、40 μmol/L，二甲雙胍組(MET)濃度為0、2.5、5、10、20、40mmol/L，聯(lián)合給藥組(COM)濃度為0、2.5+2.5、5+5、10+10、20+20、40+40(μmol/L硫利達(dá)嗪+mmol/L二甲雙胍)，每組藥物做4個(gè)復(fù)孔，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h。每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，培養(yǎng)4h。每孔加入DMSO 150μL，使用酶標(biāo)儀在490nm處測定吸光度(OD)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值，設(shè)定對(duì)照組存活率為1。

1.2.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將H1975細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度至500個(gè)/mL，每孔1mL鋪至6孔板內(nèi)培養(yǎng)24h后給藥。對(duì)照組(CON)給藥濃度為0、THZ組1μmol/L、MET組1mmol/L、COM組1μmol/L硫利達(dá)嗪+1mmol/L二甲雙胍，培養(yǎng)至克隆形成。結(jié)晶紫染色后拍照并計(jì)數(shù)。克隆形成率=實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。設(shè)定對(duì)照組克隆形成率為1。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

預(yù)先將細(xì)胞饑餓24h。將細(xì)胞消化下來用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/mL。用含20%血清的1640培養(yǎng)基配制藥物，CON組給藥濃度為0、THZ組5μmol/L、MET組5mmol/L、COM組5μmol/L硫利達(dá)嗪+5mmol/L二甲雙胍。上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入500μL藥物。培養(yǎng)24h后，用結(jié)晶紫將小室進(jìn)行染色晾干后拍照并計(jì)數(shù)。細(xì)胞遷移率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。設(shè)定對(duì)照組遷移率為1。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

預(yù)先將細(xì)胞饑餓24h。將Matrigel膠與1640按1∶8比例混合均勻，每個(gè)小室加入100μL的混合液，以上步驟冰上操作。放置培養(yǎng)箱30min使膠凝固，將未凝固的培養(yǎng)基吸出。用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×105個(gè)/mL。用含20%血清的1640培養(yǎng)基配制藥物，CON給藥濃度為0、THZ組5μmol/L、MET組5mmol/L、COM組5μmol/L硫利達(dá)嗪+5mmol/L二甲雙胍。上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入500μL藥物。放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，使用結(jié)晶紫染色晾干后拍照并計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲率=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。設(shè)定對(duì)照組侵襲率為1。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

將COM組0、THZ組10μmol/L、MET組10mmol/L及COM組10μmol/L硫利達(dá)嗪+10mmol/L二甲雙胍作用8h的細(xì)胞提取蛋白。配制裂解液：加入RIPA裂解液、EDTA、磷酸化蛋白酶抑制劑、總蛋白酶抑制劑。用PBS將細(xì)胞潤洗3次，加入裂解液使細(xì)胞充分裂解后開始離心(12 000r/min，4℃，15min)，離心后取上清液并記錄體積，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度；在各蛋白中加入一定體積的5×SDS-PAGE Loading buffer后進(jìn)行煮沸變性。制備不同濃度的凝膠，每孔上樣量不低于50μg；電泳至底部。PVDF膜用甲醇激活后與膠放置在轉(zhuǎn)膜夾內(nèi)開始轉(zhuǎn)膜(270mA，70min)。5%脫脂牛奶封閉1h；在抗體孵育盒內(nèi)加入對(duì)應(yīng)的一抗放置4℃冰箱內(nèi)的搖床上搖床過夜，將條帶用TBST 潤洗3次，加入對(duì)應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1h，再將條帶用TBST潤洗3次，每次10min，顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。樣本均數(shù)用Graphpad prism 8.0的非配對(duì)t檢驗(yàn)，兩藥聯(lián)合指數(shù)采用CompuSyn軟件進(jìn)行計(jì)算，CI>1表示拮抗，CI=1表示相加，CI<1表示協(xié)同/增敏，CI<0.4表示強(qiáng)協(xié)同/增敏。

2 結(jié) 果

2.1 二甲雙胍聯(lián)合硫利達(dá)嗪增強(qiáng)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用

通過觀察二甲雙胍和硫利達(dá)嗪對(duì)H1975細(xì)胞的影響，在給藥時(shí)間相同的條件下，隨著給藥劑量的增加，細(xì)胞活性下降；在給藥濃度相同的條件下，隨著給藥時(shí)間延長，細(xì)胞活性下降但下降不明顯；在相同的給藥時(shí)間條件下，與MET組和THZ組相比，COM組的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)CI<1，在低濃度給藥24h時(shí)CI可達(dá)0.24，因此，二甲雙胍與硫利達(dá)嗪具有強(qiáng)協(xié)同/增敏作用。見圖1。

A、B.給藥24h細(xì)胞活力；C、D.給藥48h細(xì)胞活力；E.給藥24h各組聯(lián)合指數(shù)；F.給藥48h各組聯(lián)合指數(shù)(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

2.2 二甲雙胍聯(lián)合硫利達(dá)嗪增強(qiáng)對(duì)肺癌細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用

觀察H1975細(xì)胞的克隆形成率，與CON組相比，MET組降低34.7%，THZ組降低23.2%，COM組降低96.4%；COM組較之MET組克隆形成率降低61.7%，比THZ組降低73.2%。見圖2。

A.克隆形成圖；B.克隆形成率比較(***P<0.001)

2.3 二甲雙胍聯(lián)合硫利達(dá)嗪增強(qiáng)對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的抑制作用

觀察H1975細(xì)胞的細(xì)胞遷移率，與CON組相比，MET組降低42.3%，THZ組降低8.6%，COM組降低92.1%；COM組較MET組細(xì)胞遷移率降低49.8%，比THZ組降低83.5%。見圖3。

A.細(xì)胞遷移圖片(×100)；B.細(xì)胞遷移率比較(***P<0.001)

2.4 二甲雙胍聯(lián)合硫利達(dá)嗪增強(qiáng)對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的抑制作用

觀察H1975細(xì)胞的細(xì)胞侵襲率，與CON組相比，MET組降低40.5%，THZ組降低5.7%，COM組降低71.3%；COM組較MET組細(xì)胞遷移率降低30.8%，比THZ組降低65.6%。見圖4。

A.細(xì)胞侵襲圖片(×100)；B.細(xì)胞侵襲率比較(***P<0.001)

2.5 二甲雙胍聯(lián)合硫利達(dá)嗪對(duì)肺癌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

觀察H1975細(xì)胞的總的Akt、PI3K、mTOR蛋白表達(dá)水平，3組間沒有明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與CON組相比，MET、THZ組和COM組P-Akt蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P<0.01)；與MET組和THZ組相比，COM組p-Akt蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。與CON組相比，MET、THZ組和COM組P-PI3K蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)；與單藥組相比，COM組P-PI3K蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.001)。與CON組相比，MET、THZ組和COM組p-mTOR蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.001)；與單藥組相比，COM組p-mTOR蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。見圖5。

(**P<0.01；***P<0.001)

3 討 論

二甲雙胍是治療2型糖尿病的一線用藥，具有穩(wěn)定、高效、安全性高等特點(diǎn)。二甲雙胍的降糖機(jī)制主要包括減少肝臟糖異生，增加外周葡萄糖的攝取和利用，改善胰島素的敏感性等[7]。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠抑制肺癌、胃癌、乳腺癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌等癌細(xì)胞增殖[8]。

硫利達(dá)嗪是靶向于多巴胺受體 (DR2) 抗精神病藥，已有報(bào)道硫利達(dá)嗪對(duì)肝癌干細(xì)胞[9]和胃腸腫瘤[10]有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)[11]，在卵巢癌中，硫利達(dá)嗪通過PI3K下游的信號(hào)分子的磷酸化，包括Akt和mTOR，抑制卵巢腫瘤的生長。

二甲雙胍聯(lián)合其他藥物用于抗腫瘤已有研究，如克唑替尼[12]、IL-12[13]以及放療藥物等[14]。硫利達(dá)嗪與順鉑[14]、姜黃素、白藜蘆醇[16]等聯(lián)合用于抗腫瘤已見報(bào)道。本研究首次將二甲雙胍與硫利達(dá)嗪聯(lián)合使用用于抗癌。細(xì)胞的增殖和凋亡失去平衡是腫瘤形成的主要原因。因此，本研究采用MTT法檢測肺癌細(xì)胞活力，并計(jì)算兩藥的聯(lián)合指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩藥均能抑制肺癌細(xì)胞增殖，且具有協(xié)同增效作用。此外，本研究也做了平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測肺癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲是腫瘤惡化的主要原因。因此，本研究采用遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測兩藥對(duì)肺癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩藥能夠協(xié)同抑制肺癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。因此，協(xié)同使用硫利達(dá)嗪與二甲雙胍有望成為治療癌癥的新方法。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，與細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡等過程密切相關(guān)。Akt是PI3K的下游基因，活化的PI3K能夠激活A(yù)kt，從而調(diào)控細(xì)胞的各種生命活動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。mTOR是一個(gè)289kDa絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長、增殖和存活中起調(diào)節(jié)作用。mTOR有不同的復(fù)合物，mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)，mTORC1主要參與細(xì)胞凋亡[18]。 本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測到協(xié)同使用硫利達(dá)嗪和二甲雙胍后，H1975細(xì)胞內(nèi)p-Akt/p-PI3K/p-mTOR蛋白的表達(dá)水平均降低，且聯(lián)合給藥組明顯低于單藥組，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明硫利達(dá)嗪協(xié)同二甲雙胍抑制肺癌細(xì)胞可能是通過阻斷PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活發(fā)揮作用，且聯(lián)合使用兩藥對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活的阻斷作用優(yōu)于單獨(dú)使用兩藥。

本研究尚有許多后續(xù)問題待解決，且未涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此，硫利達(dá)嗪聯(lián)合二甲雙胍抑制肺癌在動(dòng)物體內(nèi)的作用還未可知。此外，兩藥協(xié)同使用是否對(duì)其它癌癥也有效還有待研究。在作用機(jī)制方面，兩藥是否也可調(diào)控其它癌癥相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮作用也未可知。因此，本研究尚存在許多問題，有待進(jìn)一步研究。