劉陽(yáng)生

(咸寧市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 咸寧 437000)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞約占大腦總體積50%[1]，它為神經(jīng)元提供能量與營(yíng)養(yǎng)支持，調(diào)節(jié)突觸活性，還可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)外離子、水以及神經(jīng)遞質(zhì)的平衡，影響神經(jīng)元的電活動(dòng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞的這些特點(diǎn)決定其在缺血性腦損傷、神經(jīng)細(xì)胞再生和神經(jīng)退行性疾病中均發(fā)揮著重要作用[2]。高純度星形膠質(zhì)細(xì)胞的獲得是體外研究其功能和機(jī)制的基礎(chǔ)。星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)過(guò)程中，易混雜多種細(xì)胞成分如成纖維細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此，建立一種穩(wěn)定有效的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)純化方法是體外研究的前提，為體外研究其功能和機(jī)制打下基礎(chǔ)。

瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)是重要的Ca2+通道，廣泛分布于從酵母到人類的各種生物體，通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)游離鈣的濃度而發(fā)揮重要作用，有研究表明其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)[3]。哺乳動(dòng)物TRP超家族可分為TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPP、TRPV和TRPN 7個(gè)家族，在體內(nèi)分布廣泛，TRPC離子通道是位于細(xì)胞膜上的一類非選擇性陽(yáng)離子通道，迄今，已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)7種TRPC蛋白：TRPC1、C2、C3、C4、C5、C6和C7，其中TRPC2為一種假基因編碼故在人體內(nèi)缺失[4]。鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流(SOCE)，即細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)耗竭，從而引發(fā)胞外Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的這一過(guò)程，SOCE鈣通道的開(kāi)放或關(guān)閉，調(diào)節(jié)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。一般認(rèn)為，SOCE通道有賴于TRPC和Orai(calcium-release-activated-calcium channel protein)的參與[5]。眾所周之，星形膠質(zhì)細(xì)胞為非興奮性細(xì)胞，且SOCE在非興奮性細(xì)胞的鈣信號(hào)中很重要[6]，TRPC通道在培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)[7]，因此，TRPC通道在星形膠質(zhì)細(xì)胞中作為常見(jiàn)信號(hào)傳遞方式之一，胞內(nèi)Ca2+水平變化與細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、周期、分泌、興奮、代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化及凋亡等相關(guān)。TRPC通道的過(guò)表達(dá)、缺失和活化都對(duì)胞質(zhì)Ca2+水平產(chǎn)生影響，導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，繼而對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響。近年來(lái)，一些疾病被發(fā)現(xiàn)與TRPC通道的異常有關(guān)，因此，TRPC通道有望成為藥物治療的靶點(diǎn)[8]。本研究觀察體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1-7 mRNA的表達(dá)，為體外研究星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC通道與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1～3d的乳鼠40只，體質(zhì)量2～3g，C57BL/6購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用3R原則給予人道關(guān)懷，并通過(guò)倫理審查。

1.1.2 主要設(shè)備及試劑

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡FV500、FLUOVIEW共聚焦顯微鏡、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀、空氣恒溫?fù)u床、DMEM/F12培養(yǎng)基、D-hanks、PBS、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、胰蛋白酶、多聚賴氨酸、兔抗GFAP多克隆抗體、羊抗兔IgG。

1.2 方法

1.2.1 大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)

選取出生3d以內(nèi)的乳鼠備用。取腦前為減少腦部血供用冰包埋4min，再用75%酒精消毒，用眼科剪剪開(kāi)皮膚，剔除覆蓋于大腦上半部分的顱骨并取腦置于4℃ D-Hanks中。大腦經(jīng)冰的D-Hanks漂洗后，放置于消毒過(guò)的濾紙上吸除多余液體，用眼科彎鑷摘除大腦半球，仔細(xì)剝離海馬、腦膜和血管等纖維成分。移入EP管內(nèi)，用眼科剪充分剪碎，加入1mL 0.25%胰酶，置于培養(yǎng)箱37℃消化15min，每5min震蕩一次，用混有10%FBS的DMEM-F12終止消化，用吸管反復(fù)輕輕吹打，混勻至無(wú)明顯組織塊，吸取液體過(guò)200目篩網(wǎng)后1 000rpm離心5min，棄上清液，加入混有15%FBS的DMEM-F12重懸，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育差速貼壁培養(yǎng)，于30min、1h分別取出并輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出上清液以除去貼壁的成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至新的培養(yǎng)瓶中，24h后全量換液，以后3d換液一次。9d后待細(xì)胞生長(zhǎng)分層，將培養(yǎng)瓶放入37℃搖床260rpm搖晃18h，棄除小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，溫D-Hanks漂洗細(xì)胞，用0.25%胰酶消化、傳代，減半接種，待37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5d鋪滿瓶底，消化、傳代，一半細(xì)胞接種繼續(xù)培養(yǎng)，其余細(xì)胞接種于蓋玻片，免疫熒光法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.2.2 大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞所特有的骨架蛋白，可作為成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物[9]。采用免疫熒光染色對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。步驟如下：星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于蓋玻片上，24h后經(jīng)PBS漂洗，置于4%多聚甲醛中浸泡固定30min；細(xì)胞標(biāo)本用PBS漂洗3次，10min/次；0.1%Triton滴于細(xì)胞上破膜5min；PBS漂洗3次，10min/次；將10%的羊血清滴于細(xì)胞標(biāo)本上封閉30min；3%BSA稀釋一抗，配制成兔抗GFAP(1∶500)工作濃度，一抗滴覆于細(xì)胞標(biāo)本上，4℃孵育過(guò)夜；PBS漂洗蓋玻片3次，10min/次；羊抗兔CY3(1∶2000)二抗避光孵育2h；二抗孵育后PBS漂洗3次，10min/次；將蓋玻片倒扣于處理過(guò)的載玻片上，甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下20倍觀察拍照。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR

根據(jù)GenBank小鼠TRPC1-7序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：TRPC1上游5′-CTCAAAGTGGTGGCTCACAACAAG-3′下游5′-CATAGAGCTGAGTCAGTCCAATCG-3′；TRPC2上游5′-GGCTGTCAACTACAACCAGAAACAG-3′下游5′-AGCTGGCAGAATATATGCCAGTCG-3′；TRPC3上游5′-GGACTGTCTGAAGTGACTTCTGTT-3′，下游5′-CTCGAGTGAGACTGTGTGAAGAGG-3′；TRPC4上游5′-GTGGAGTGGATGATATTACCGTGG-3′，下游5′-TCAGGATGTCCAGAAGCATCCTTC-3′；TRPC5上游5′-TCCATGATTGGTGGAACCTGATGG-3′，下游5′-AGCATATTCAGCAGCACTACCAGG-3′；TRPC6上游5′-CCTACTGATCCTCAGATCATCTCT-3′，下游5′-CTCTGCATCTTCTTGGAAGCCTTG-3′；TRPC7上游5′-GACGGAGATGCTCATCATGAAGTG-3′，下游5′-CGGTAGTAGGAGTACAGGTTGAAC-3′PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 1μL，上游引物和下游引物各1μL，2×Mix 6.3μL，超純水4.2μL，總體系12.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火30s，退火溫度：TRPC1 64.6℃，TRPC2 64.2℃，TRPC3 64.2℃，TRPC4 65.7℃，TRPC5 65.9℃，TRPC6 64.2℃，TRPC7 65.2℃，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min。最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié) 果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定

體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，GFAP陽(yáng)性的細(xì)胞可達(dá)總細(xì)胞數(shù)的95%，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP細(xì)胞胞質(zhì)為綠光標(biāo)記，DAPI細(xì)胞胞核為藍(lán)光標(biāo)記，見(jiàn)圖1(封三)。

2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1-7 mRNA的表達(dá)

RT-PCR產(chǎn)物證實(shí)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞上有TRPC1-7 mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 星形膠質(zhì)細(xì)胞TRPC1-7 mRNA的表達(dá)

3 討 論

星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化是進(jìn)行其功能研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)選取出生3d以內(nèi)的乳鼠，其腦組織分離細(xì)胞懸液中星形膠質(zhì)細(xì)胞含量較多，且新生鼠腦膜較易剝離[10]，腦膜和血管等纖維成分對(duì)細(xì)胞的污染會(huì)降低，有利于星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁相對(duì)較緩慢，因此，培養(yǎng)瓶預(yù)先用低濃度的多聚賴氨酸預(yù)包被，發(fā)現(xiàn)3～5h后絕大多數(shù)細(xì)胞貼壁良好。在細(xì)胞培養(yǎng)中，加入15%胎牛血清和DF12培養(yǎng)液重懸，未使用任何其它添加物，星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好。

組織消化時(shí)要選擇合適的消化時(shí)間，避免消化過(guò)度從而對(duì)細(xì)胞造成較大的損傷。傳代時(shí)胰酶的使用濃度0.25%較適宜，且消化時(shí)要密切觀察細(xì)胞的狀態(tài)，及時(shí)終止消化，傳代時(shí)減半接種。

原代分離的細(xì)胞懸液中，有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選擇日齡合適的乳鼠，多次消化傳代、減半接種以及純化時(shí)借助37℃搖床機(jī)械振蕩，獲得了較純的星形膠質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)選取適齡乳鼠、分離組織時(shí)仔細(xì)剝離腦膜和血管等纖維成分、使用差速貼壁技術(shù)，來(lái)減少成纖維細(xì)胞的污染。至于培養(yǎng)物中的神經(jīng)元，沒(méi)有特定的培養(yǎng)液在體外難以存活。少突膠質(zhì)細(xì)胞在原代培養(yǎng)時(shí)位于星形膠質(zhì)細(xì)胞層上，可借助恒溫?fù)u床機(jī)械振蕩、多次傳代去除。

TRPC每四個(gè)家族蛋白可形成同源或異源四聚體，四聚體組成非選擇性陽(yáng)離子通道，鈣離子經(jīng)此通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在神經(jīng)系統(tǒng)，TRPCs參與神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化、神經(jīng)元保護(hù)、軸突生長(zhǎng)及導(dǎo)向、突觸形成等一系列神經(jīng)生理功能，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。如何通過(guò)干預(yù)腦內(nèi)TRPC治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，從而發(fā)掘新型治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物成為研究的熱點(diǎn)[11]。有研究[7]報(bào)道TRPC通道(TRPC1-6)在培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)也觀察到培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞上存在TRPC通道，有TRPC1-7 mRNA的表達(dá)。

在神經(jīng)系統(tǒng)，TRPCs與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病相關(guān)[12]，因此，利用星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)進(jìn)行TRPC表達(dá)研究越來(lái)越受到重視。培養(yǎng)較純的、穩(wěn)定的星形膠質(zhì)細(xì)胞是在體外研究TRPC通道的前提條件，對(duì)闡明和研究其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用以及為發(fā)掘新型治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物或干預(yù)措施奠定理論基礎(chǔ)。