張廣華，劉丹陽，何 碩，范國凱，於麗華，王宇光，耿 貴

(黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080)

0 引 言

近年來，全球20%的耕地受到鹽脅迫的影響，中國9.2×107hm2的耕地正面臨著鹽漬化的影響[1]。用物理和化學(xué)方法改良鹽漬化土壤成本過高，培養(yǎng)耐鹽作物成為改良鹽堿地的重要舉措之一，能改良土壤性質(zhì),并能產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益，因此對作物耐鹽機制的研究尤為重要[2]。甜菜是我國主要的糖料作物之一，具有較高的耐鹽性和極強的適應(yīng)性，是開發(fā)利用鹽堿地的理想作物[3]。鹽脅迫是限制作物生長的主要非生物脅迫，鹽分以滲透脅迫和離子毒性的形式制約植物的生長。Na+和Cl-在植物組織中的積累破壞了植物體內(nèi)的離子平衡，并且過高的Na+濃度會限制植物對K+的吸收，間接影響植株的生長[4]。

研究表明，低濃度的鹽會對甜菜的生長起到促進(jìn)作用,但是高濃度的鹽會抑制甜菜的生長。施加0.75～9 mmol·L-1的Na+可以促進(jìn)甜菜幼苗生長，葉面積和干物質(zhì)量增加[5-6]。在NaCl濃度為80～180 mmol·L-1時，對甜菜干物質(zhì)量的積累并無影響，在濃度為280～380 mmol·L-1時則會抑制甜菜干物質(zhì)量的積累[7]。植物可通過改變自身的生理變化來適應(yīng)鹽脅迫，比如積累可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來提高細(xì)胞的保水能力[8-10]。王宇光等研究發(fā)現(xiàn)，在Na+濃度>25 mmol·L-1時，過氧化氫酶 (Catalase, CAT) 和抗壞血酸過氧化物酶 (Ascorbate peroxidase, APX)的活性均提高[11]。作物對鹽脅迫的響應(yīng)，目前多數(shù)研究通過改變Na+的濃度以及對作物進(jìn)行長時間的脅迫來探究作物對鹽脅迫的響應(yīng)機制，對于作物在鹽脅迫下短時間內(nèi)的生理變化機制探討很少。本研究通過研究短期鹽脅迫條件下甜菜幼苗的生理傷害和適應(yīng)變化為甜菜耐鹽機制的研究以及耐鹽作物的培育奠定理論基礎(chǔ)。

1 研究材料與方法

1.1 供試材料

甜菜品種T510。

1.2 實驗設(shè)計

本研究在黑龍江大學(xué)農(nóng)學(xué)樓光培室內(nèi)進(jìn)行，采用改良的1/2霍格蘭營養(yǎng)液進(jìn)行水培研究。選取大小均勻一致且飽滿的甜菜種子，在發(fā)芽盒內(nèi)利用滅菌的蛭石進(jìn)行培育。發(fā)芽條件為光照強度420 umol·m-2·s，每天光照時間段為6:00—20:00，晝夜溫度為25 ℃/20 ℃，濕度為65%。培育6 d后，選取大小一致的甜菜幼苗移植到含有2.5 L營養(yǎng)液的玻璃槽中(營養(yǎng)液PH為5.6)。每槽4穴，每穴兩株，7 d換一次營養(yǎng)液，培養(yǎng)28 d后開始進(jìn)行NaCl脅迫處理，脅迫處理0、3、6、12、24、48 h后分別取樣測定。

1.3 測定方法

使用Li-6400便攜式光合儀(Li-Cor Inc,USA)測定各葉片的凈光合速率(Net photosynthetic rate, Pn)、蒸騰速率(Transpiration rate, Tr)、胞間CO2濃度(Intercellular CO2concentration, Ci)和氣孔導(dǎo)度(Stomatal conductance, Gs)。參照呂春華等[12]的方法測定甜菜幼苗MDA、可溶性蛋白、脯氨酸的含量。測定葉片相對含水量參照鄒琦等[13]的方法，甜菜收獲后用天平稱取葉片鮮重，將葉片放入烘干箱中，105 ℃下殺青1 h，80 ℃烘干至恒重，用天平稱取干重，用所得數(shù)據(jù)通過式(1)計算相對含水量(RWC)。

(1)

1.4 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

利用Microsoft office Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析；利用IBM SPSS 2020數(shù)據(jù)分析軟件的單因素方差分析對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對幼苗生長的傷害指標(biāo)動態(tài)變化

2.1.1 短期鹽脅迫對甜菜氣孔交換參數(shù)的影響

氣孔交換參數(shù)能夠直接反映植物光合作用的強弱(表1)。由表1可見，甜菜葉片的Tr、 Gs、 Pn、 Ci對鹽脅迫的響應(yīng)基本一致，即隨著脅迫時間的增加甜菜葉片的氣孔交換參數(shù)呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。在脅迫12 h前葉片的Tr、 Gs、 Pn、 Ci快速下降，且均在脅迫12 h達(dá)到最低值，分別比脅迫0 h降低了84.8%、87.3%、95.1%、67.5%，呈顯著性差異(P<0.05)。脅迫48 h葉片的Tr、 Gs、 Pn、 Ci相比于脅迫12 h有所增強，增幅分別為192.4%、307.4%、1093.2%、105.5%。以上研究結(jié)果說明脅迫12 h對甜菜光合作用影響最大，脅迫24 h、48 h甜菜通過自我修復(fù)使光合作用有所增強。

表1 短期鹽脅迫對甜菜氣體交換參數(shù)的的影響Table 1 Influence of short-term salt stress on gas exchange parameters of sugar beet

2.1.2 短期鹽脅迫對甜菜MDA含量的影響

MDA是膜系統(tǒng)受傷的主要產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)可通過測定MDA的含量來評價植物的受脅迫程度見圖1。由圖1可見，隨著脅迫時間的增加MDA的含量逐漸增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在脅迫12 h時達(dá)到峰值，比脅迫0 h增加了64.5%，呈顯著性差異(P<0.05)。脅迫3 h與脅迫0 h相比沒有顯著差異，說明脅迫3 h對甜菜膜系統(tǒng)的傷害很小。脅迫24 h、48 h的MDA含量分別比脅迫12 h降低了7.9%和19.7%,呈顯著性差異(P<0.05)，此時MDA的含量開始下降。研究結(jié)果說明，脅迫12 h對甜菜膜系統(tǒng)傷害最大，大小比較為12 h>24 h>48 h>6 h>3 h>0 h。

圖1 短期鹽脅迫對甜菜MDA含量的影響Fig.1 Effects of short-term salt stress on MDA content in sugar beet注：圖中不同小寫字母表示不同脅迫時間MDA含量差異達(dá)到P<0.05的顯著性水平。

2.1.3 短期鹽脅迫對甜菜相對含水量的影響

葉片相對含水量能直觀反映出植物體內(nèi)的水分代謝狀況見圖2。由圖2可見，隨著脅迫時間的不斷增加，葉片相對含水量受到了不同程度的抑制，呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。脅迫12 h前相對含水量快速下降，在脅迫時間為12 h時達(dá)到最低值，比脅迫0 h降低了4%，呈顯著性差異(P<0.05)。但脅迫3 h和脅迫0 h相比沒有顯著性差異，波動幅度很小。脅迫24 h、48 h甜菜體內(nèi)的水分代謝情況有所緩解，比脅迫12 h分別增加了1.1%和1.8%。研究結(jié)果說明，脅迫12 h對甜菜體內(nèi)水分代謝的影響最大，脅迫12 h后甜菜體內(nèi)的相對含水量逐漸增加，植株開始對鹽脅迫造成的過度失水做出適應(yīng)調(diào)整。

圖2 短期鹽脅迫對甜菜相對含水量含量的影響Fig.2 Influence of short-term salt stress on relative water content of sugar beet注：圖中不同小寫字母表示不同脅迫時間相對含水量差異達(dá)到P<0.05的顯著性水平。

2.2 鹽脅迫對幼苗生長的適應(yīng)指標(biāo)動態(tài)變化

可溶性蛋白是植物體內(nèi)適應(yīng)干旱、寒冷、鹽漬等逆境中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(圖3(a))。由圖3(a)可見，隨著脅迫時間的增加，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在脅迫12 h前可溶性蛋白含量快速積累，細(xì)胞滲透壓增加。脅迫12 h達(dá)到峰值，脅迫12 h比脅迫0 h可溶性蛋白含量增加了32.6%，呈顯著性差異(P<0.05)。脅迫12 h后可溶性蛋白含量開始下降，脅迫48 h比脅迫12 h可溶性蛋白含量降低了13.3%，呈顯著性差異(P<0.05)。

脯氨酸在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和保持細(xì)胞膜的完整性方面發(fā)揮重要的作用，同時也是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物體內(nèi)脯氨酸含量的增加是植物適應(yīng)逆境的一種保護(hù)性措施(圖3(b))。由圖3(b)可見，隨著脅迫時間的增加脯氨酸含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，與可溶性蛋白含量變化趨勢一致，但脯氨酸含量變化幅度更大。脅迫12 h時脯氨酸含量達(dá)到最大值，比脅迫0 h脯氨酸含量增加了100.41%，呈顯著性差異(P<0.05)。脅迫24 h、48 h脯氨酸含量下降，但分別比脅迫0 h增加了79.1%、62.9%，呈顯著性差異(P<0.05)。說明甜菜在受到脅迫12 h前通過不斷增加脯氨酸含量來適應(yīng)逆境，脅迫12 h后甜菜體內(nèi)脯氨酸含量開始降低。

圖3 短期鹽脅迫對甜菜可溶性蛋白、脯氨酸含量的影響Fig.3 Effects of short-term salt stress on soluble protein and proline contents in sugar beet注：圖中不同小寫字母表示不同脅迫時間可溶性蛋白、脯氨酸含量差異達(dá)到P<0.05的顯著性水平。

3 討 論

植物葉片的氣孔交換參數(shù)是衡量其光合作用強弱的重要指標(biāo)，植物在鹽脅迫下光合速率降低，原因包括氣孔限制因素和非氣孔限制因素[14-15]。若Ci和Gs的變化趨勢一致，Ci隨著Gs的降低而降低則為氣孔限制因素。若Ci和Gs的變化趨勢不一致，Ci隨著Gs的降低不變或增加則為非氣孔限制因素[16]。在NaCl濃度為100 mmol·L-1時，辣椒光合速率下降主要與非氣孔限制因素有關(guān)，當(dāng)NaCl濃度>150 mmol·L-1時，辣椒光合速率下降主要與氣孔限制因素有關(guān)[17]。鹽脅迫下蒙古蕕苗木葉片光合速率下降的原因是非氣孔限制因素[18]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時間的增加甜菜葉片的Tr、Gs、Pn、Ci均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢。甜菜葉片Ci和Gs的變化趨勢是一致的，因此甜菜幼苗凈光合速率的變化趨勢可能是由氣孔限制因素影響的，甜菜通過關(guān)閉氣孔來減少水分的散失，導(dǎo)致甜菜光合作用減弱。在脅迫12 h時氣體交換參數(shù)達(dá)到最低，此時甜菜幼苗光合作用受到的影響最大。

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合造成蛋白質(zhì)分子內(nèi)與分子外的交聯(lián)，從而破壞生物膜的結(jié)構(gòu)與功能，測定MDA的含量來測定植株受損傷程度[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫12 h時甜菜葉片MDA含量達(dá)到最高值，在脅迫12h后MDA含量開始逐漸降低，說明脅迫后期甜菜膜脂質(zhì)過氧反應(yīng)開始減緩，其對于鹽脅迫有較強的適應(yīng)能力。相對含水量是植物在抗逆過程中衡量其體內(nèi)水分狀況的重要指標(biāo)，其值越大，說明其體內(nèi)水分代謝能力越強[20]。前人研究結(jié)果表明隨著鈉離子濃度的增加葉片相對含水量逐漸降低[20]，本試驗結(jié)果表明，在同一鈉離子濃度下脅迫12 h時甜菜葉片相對含水量達(dá)到最低值，在脅迫24 h、48 h時相對含水量增加，這是有機滲透物質(zhì)與無機滲透物質(zhì)共同調(diào)節(jié)從而減緩甜菜因鹽脅迫造成的水分缺失，維持細(xì)胞的正常代謝?？扇苄缘鞍住⒏彼崾侵参矬w內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物通過增加和積累其含量來保持滲透平衡、保持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性并清除氧自由基，對于提高植物的耐鹽性具有重要作用[21]。植物體內(nèi)主要有3種滲透調(diào)節(jié)途徑：①從外界介質(zhì)中吸收滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；②植株自身合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)；③增加Na+和K+的濃度進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)[22]。鹽脅迫對植物的傷害首先表現(xiàn)為過度失水，在脅迫12 h前可溶性蛋白、脯氨酸含量快速增加，說明在鹽脅迫前期植物體內(nèi)通過增加可溶性蛋白、脯氨酸的含量來維持細(xì)胞滲透壓平衡，與郭艷超等[21]、楊洋等[23]研究結(jié)果一致。在脅迫12 h后甜菜體內(nèi)可溶性蛋白、脯氨酸的含量增長減緩，由于植物體內(nèi)的Na+和Cl-等離子的含量逐漸升高導(dǎo)致植物體內(nèi)滲透壓升高，植物通過離子和來維持體內(nèi)的滲透平衡[24]。鹽脅迫前期植物通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來適應(yīng)逆境，脅迫后期由于植株體內(nèi)無機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)逐漸升高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加減緩。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在280 mmol·L-1的鹽脅迫條件下，甜菜的氣孔交換參數(shù)、相對含水量呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，在脅迫12 h達(dá)到最低值。甜菜體內(nèi)的MDA、脯氨酸、可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在脅迫12 h達(dá)到最高值。脅迫前期甜菜積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來提高體內(nèi)滲透壓來增強細(xì)胞的保水性。隨著脅迫時間的增加，植物體內(nèi)的Cl-和Na+等無機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)逐漸增加，甜菜體內(nèi)的脯氨酸、可溶性蛋白的增長速率減慢。