吳 楠, 宋奕凝, 季寶成, 白艷紅

(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 鄭州 450001)

1 引 言

熒光素酶是生物發(fā)光成像技術(shù)的核心，將其標(biāo)記在目標(biāo)生物大分子上，通過測(cè)定酶催化產(chǎn)生的光信號(hào)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記物的非侵入性監(jiān)控. 熒光素酶具有高檢測(cè)靈敏度，無(wú)毒，易操作，成本低，良好的標(biāo)記穩(wěn)定性以及標(biāo)記傳代性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療，制藥，生物科研等各個(gè)行業(yè)[1]. 最近，熒光素酶在高靈敏度病毒檢測(cè)[2]，病毒致病機(jī)制分析[3]，以及抗病毒藥物篩選[4]方面的應(yīng)用研究報(bào)道逐年增多. 考慮到近年來(lái)在我國(guó)SARS-CoV，H7N9以及最近的COVID-19等病毒引起的公共安全問題頻發(fā)[5]，熒光素酶技術(shù)的諸多優(yōu)良特性將保證其在病毒的研究和防治中承擔(dān)越來(lái)越重要的角色.

nanoKAZ是一種通過蛋白質(zhì)工程改造的熒光素酶，改造基體是熒光素酶OplophorusLuciferase(OLuc). OLuc源于一種深海發(fā)光磷蝦Oplophorusgracilirostris，可以催化底物coelenterazine (CTZ)的氧化反應(yīng)產(chǎn)生峰值為460 nm的藍(lán)光[6]. 分離純化后的OLuc分子量為130 kDa，經(jīng)western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OLuc由分子量為35 kDa和19 kDa的兩個(gè)小蛋白亞基組成[7]. 發(fā)光活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明OLuc的催化區(qū)位于19 kDa蛋白亞基上. 目前已有課題組向該亞基引入16個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變優(yōu)化發(fā)光活性，所構(gòu)建突變體被命名為nanoKAZ. 相較其他熒光素酶nanoKAZ具有以下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1)分子量小，在標(biāo)記過程中不會(huì)對(duì)標(biāo)記分子的理化性質(zhì)產(chǎn)生較大影響；2)對(duì)底物專一性依賴程度低，可以通過開發(fā)底物類似物的方法較方便且高效改造nanoKAZ的催化發(fā)光性質(zhì)[8]. 因此nanoKAZ被認(rèn)為是一種潛在理想的報(bào)告蛋白.

目前nanoKAZ的晶體結(jié)構(gòu)已被報(bào)道(PDB ID：5BOU). 結(jié)構(gòu)顯示nanoKAZ為單結(jié)構(gòu)域分子，主要由11個(gè)反平行β折疊(β1-β11)形成的桶狀結(jié)構(gòu)(β桶)與4個(gè)α螺旋(α1-α4)構(gòu)成. 除α1外，其余三個(gè)α螺旋(α2-α4)在空間上靠近，與β桶間圍城一個(gè)大小可容納一個(gè)CTZ分子的空腔(圖1A). 空腔內(nèi)疏水性高且富集正電荷，被認(rèn)為是nanoKAZ的潛在催化腔[9]. 然而，目前該催化腔與底物的結(jié)合模式仍然未知，其主要原因是nanoKAZ催化底物反應(yīng)速度極快，難以解析nanoKAZ與CTZ結(jié)合復(fù)合體的結(jié)構(gòu). 由于缺乏nanoKAZ與底物結(jié)合模式的信息，目前nanoKAZ的改造研究進(jìn)展緩慢.

本研究利用nanoKAZ結(jié)構(gòu)信息，采用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)對(duì)nanoKAZ的潛在催化腔與底物的作用過程進(jìn)行模擬，解析nanoKAZ與底物的結(jié)合中間態(tài)，觀察底物對(duì)nanoKAZ主鏈運(yùn)動(dòng)性造成的影響，查找nanoKAZ分子中與底物發(fā)生直接作用的氨基酸殘基位點(diǎn)，對(duì)nanoKAZ的分子改造提供了有效信息，也為提升nanoKAZ的應(yīng)用價(jià)值打下了前提和基礎(chǔ).

2 材料與方法

2.1 材 料

本研究使用軟件為分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件：GROMACS(Ver. 2019.1)[10]；酶與底物結(jié)合自由能計(jì)算與分解軟件：g_mmpbsa(Ver. 5.1.2，含APBS計(jì)算程序組件)[11]；二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算軟件DSSP(Ver. 3.0.0-2)[12];分子對(duì)接軟件：AutoDock(Ver. 4.2)與 AutoDockTools(Ver. 1.5.6)[13]；分子結(jié)構(gòu)可視化軟件：PyMOL(Ver. 2.3.2).

2.2 方 法

2.2.1分子對(duì)接

在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)Proten Data Bank(https://www.rcsb.org/)中下載nanoKAZ的結(jié)構(gòu)文件(PDB ID：5BOU)，使用PyMOL軟件將A鏈結(jié)構(gòu)導(dǎo)出并保存(圖1A). 在小分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)The Automated Topology Builde(ATB，http://atb.uq.edu.au/)繪制并下載底物CTZ的分子結(jié)構(gòu)文件(ID: J2J4)并保存(圖1B). 分別將nanoKAZ與CTZ的結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入分子對(duì)接工具AutoDock Tools，調(diào)整對(duì)接格點(diǎn)盒子大小使其完全包裹住nanoKAZ的中心空腔并開展對(duì)接實(shí)驗(yàn). 在對(duì)接過程中使用拉馬克遺傳算法(lamarckian genetic algotithm)進(jìn)行配體構(gòu)象搜索，其余對(duì)接參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置.

圖1 構(gòu)建的nanoKAZ(A)與coelenterazine(B)的三維分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 Three-dimensional structures of nanoKAZ (A) and coelenterazine (B)

2.2.2分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)模擬采用GROMACS 2019軟件包，設(shè)定蛋白質(zhì)力場(chǎng)為GROMOS96 54A7，水分子使用SPC模型，底物分子的拓?fù)湮募c力場(chǎng)參數(shù)均通過ATB服務(wù)器計(jì)算獲得. 分別以nanoKAZ的單酶apo態(tài)(apo-nanoKAZ)和nanoKAZ與底物的對(duì)接復(fù)合體(nanoKAZ-CTZ)為中心，構(gòu)建直徑為7.471 ?的立方體盒子并添加水分子進(jìn)行溶劑化，生成初始模擬體系. 兩體系中均加入7個(gè)鈉離子中和nanoKAZ自身的7個(gè)負(fù)電荷，使構(gòu)建體系保持電中性. 其后對(duì)構(gòu)建體系建立周期性邊界條件，通過最速下降法使體系能量最小化后，先后使用100 ps的NVT系綜模擬和100 ps的NPT系綜模擬平衡體系. 溫度由V-rescale耦合算法穩(wěn)定在300 K，壓強(qiáng)由Parrinello-Rahman恒壓器方法維持在1 bar(1×105Pa). 平衡后兩體系均在NPT系綜條件下繼續(xù)進(jìn)行200 ns動(dòng)力學(xué)模擬. 所有模擬過程中，時(shí)間步長(zhǎng)均設(shè)定為2 fs，每10步(20 fs)重建一次臨近列表. 所有化學(xué)鍵的鍵長(zhǎng)以LINCS方法加以限制，范德華力與靜電力相互作用分別使用Lenard-Jones函數(shù)與PME方法進(jìn)行計(jì)算，截?cái)喟霃骄O(shè)為1.4 nm.

3 結(jié) 果

3.1 篩選最優(yōu)對(duì)接復(fù)合體

使用AutoDock對(duì)nanoKAZ與CTZ進(jìn)行對(duì)接后共生成50個(gè)復(fù)合體構(gòu)象，其中16個(gè)構(gòu)象中nanoKAZ與CTZ結(jié)合方式高度類似(RMSD≤0.2 nm)，形成最大構(gòu)象簇(抑制常數(shù)316.72 μM)，且該簇在所有構(gòu)象簇中能量最低(-4.77 kJ/mol)，因此被選為最優(yōu)對(duì)接構(gòu)象. 考慮到酶與底物在溶液中對(duì)接過程應(yīng)具有動(dòng)力學(xué)特性，而半剛性對(duì)接構(gòu)象搜索難以完全體現(xiàn)真實(shí)環(huán)境中酶與底物的作用方式，因此在對(duì)接完成后，對(duì)nanoKAZ-CTZ復(fù)合體進(jìn)行了200 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬. 同時(shí)，也在相同模擬條件下對(duì)apo-nanoKAZ進(jìn)行了200 ns動(dòng)力學(xué)模擬做為對(duì)照，用以分析CTZ對(duì)nanoKAZ酶結(jié)構(gòu)造成的影響.

3.2 CTZ對(duì)nanoKAZ結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

模擬完成后，首先以30 ns的瞬時(shí)結(jié)構(gòu)做為對(duì)比模版，分別計(jì)算了apo-nanoKAZ和nanoKAZ-CTZ在200 ns模擬期間所有輸出結(jié)構(gòu)Cα的均方根方差(Root-Mean-Square Deviation，RMSD). 結(jié)果顯示在模擬過程的前100 ns期間，apo-nanoKAZ構(gòu)象變化劇烈，100 ns后結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，雖然在165 ns時(shí)出現(xiàn)約0.05 nm左右幅度短暫的RMSD震動(dòng)(維持時(shí)間小于10 ns)但整體構(gòu)象變化不大，可以判斷apo-nanoKAZ已經(jīng)處于穩(wěn)定狀態(tài)，RMSD穩(wěn)定值在0.24 nm左右. 另一方面， nanoKAZ-CTZ復(fù)合體在130 ns模擬后RMSD趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定值約為0.23 nm，與apo-nanoKAZ的模擬結(jié)果接近，說明底物的加入對(duì)nanoKAZ整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響程度較低(圖2).

圖2 nanoKAZ-CTZ與apo-nanoKAZ中蛋白結(jié)構(gòu)RMSD隨時(shí)間變化情況 Fig. 2 RMSD changes of nanoKAZ-CTZ and apo-nanoKAZ versus time duration

apo-nanoKAZ和nanoKAZ-CTZ的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性使用DSSP加以分析，結(jié)果顯示復(fù)合體nanoKAZ-CTZ中除α3螺旋(L30-L34)外所有二級(jí)結(jié)構(gòu)在模擬條件下均可維持穩(wěn)定. α3螺旋結(jié)構(gòu)則在復(fù)合體模擬進(jìn)行至100 ns左右逐漸消失為無(wú)結(jié)構(gòu)loop. 與之相對(duì)，apo-nanoKAZ內(nèi)的α3螺旋結(jié)構(gòu)在200 ns全程維持完好(圖3)，該結(jié)果表明α3螺旋在復(fù)合體內(nèi)受到較強(qiáng)能量作用導(dǎo)致維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，致使其最終被破壞.

圖3 nanoKAZ-CTZ與apo-nanoKAZ中二級(jí)結(jié)構(gòu)成分(SS contents)隨時(shí)間的變化情況 Fig. 3 Secondary structure (SS) contents changes of nanoKAZ-CTZ and apo-nanoKAZ versus time duration

3.3 nanoKAZ與CTZ的結(jié)合能計(jì)算與氫鍵分析

nanoKAZ與CTZ的結(jié)合自由能通過Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area (MM/PBSA)方法計(jì)算. 首先，基于RMSD結(jié)果截取了nanoKAZ-CTZ復(fù)合體在190 ns至200 ns模擬區(qū)間(結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定)的分子運(yùn)動(dòng)軌跡(每1 ns截取一個(gè)快照)，然后利用軟件包g_mmpbsa分別計(jì)算選取軌跡內(nèi)nanoKAZ與CTZ間的相互作用能ΔEMM(包含范德華ΔEvdw和靜電相互作用ΔEele),去溶劑化極性效應(yīng)能ΔEsolv以及去溶劑化非極性效應(yīng)能ΔESASA，最后利用公式ΔGbind=ΔEvdw+ΔEele+ΔGsolv+ΔGSASA計(jì)算出體系的結(jié)合自由能ΔEbind.計(jì)算結(jié)果顯示整個(gè)復(fù)合體結(jié)合能ΔEbind主要來(lái)源是ΔEvdw，其次分別是ΔEele和ΔESASA.去溶劑化極性效應(yīng)能ΔEsolv則是唯一的結(jié)合阻力來(lái)源，其絕對(duì)值大于ΔEele和ΔESASA但小于ΔEvdw，故被抵消.復(fù)合體的最終結(jié)合能為-193.412 ±3.799 kJ/mol(表1).

表1 使用MM/PBSA方法計(jì)算nanoKAZ-CTZ復(fù)合體的結(jié)合自由能

對(duì)體系進(jìn)行能量分解獲取單個(gè)氨基酸與CTZ間的結(jié)合自由能貢獻(xiàn)信息. 結(jié)果顯示共計(jì)15個(gè)氨基酸殘基對(duì)底物的結(jié)合自由能超過-2 kJ/mol，其中10個(gè)氨基酸殘基位于β桶區(qū)域，包括直接位于β折疊的7個(gè)氨基酸殘基Q12(β1)，P40(β2)，I56(β3)，V58(β3)，L92(β5)，F(xiàn)151(β10)，C164(β11)和 3個(gè)位于β6-β7間長(zhǎng)loop的氨基酸殘基Y109，F(xiàn)110，R112；另外5個(gè)氨基酸位于α2-α4螺旋或周邊區(qū)域，包括L18(α2)，L22(α2)，V27(α2至α3間loop)，F(xiàn)31(loop，原α3區(qū)域)和F77(α4)(圖4A，4B).

氫鍵分析結(jié)果顯示，上述殘基中的Q12和V27在120 ns后能夠分別與底物中心雜環(huán)上的氨基氫和C2位取代基團(tuán)上的酚基氫形成穩(wěn)定氫鍵(圖4B右上插入圖)，對(duì)CTZ在催化腔中的固定起重要作用.

3.4 CTZ對(duì)nanoKAZ主鏈運(yùn)動(dòng)性的影響

分別對(duì)apo-nanoKAZ和nanoKAZ-CTZ中nanoKAZ蛋白主鏈原子的均方根漲落(root mean square fluctuation，RMSF)進(jìn)行計(jì)算，分析CTZ對(duì)nanoKAZ分子的主鏈運(yùn)動(dòng)影響.

apo-nanoKAZ的分析結(jié)果顯示除β4外，nanoKAZ中的其余10個(gè)β折疊均展現(xiàn)出較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性(RMSF值小于0.2 nm). 與之相對(duì)，α螺旋區(qū)域則展現(xiàn)出較高的主鏈運(yùn)動(dòng)性，具有代表性的是片段L18-F31與片段P61-H87，兩片段在apo-nanoKAZ模擬中呈現(xiàn)多個(gè)大于0.25 nm的RMSF峰. 然而在nanoKAZ-CTZ復(fù)合體模擬中L18-F31與P61-H87的RMSF值卻下降明顯，特別是L18-F31內(nèi)RMSF峰降幅高達(dá)0.2 nm以上，表明其運(yùn)動(dòng)性在底物進(jìn)入空腔后受到抑制(圖4C). 究其原因應(yīng)該是片段L18-F31中殘基L22，V27和F31與底物結(jié)合能量較高(超過-5 kJ/mol)且V27和底物CTZ形成了穩(wěn)定氫鍵(圖4B)，從而使該片段結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)性顯著降低. 另外，與L18-F31相連的Q32-P40片段在CTZ進(jìn)入空腔后主鏈運(yùn)動(dòng)性增加，兩相鄰區(qū)段的主鏈運(yùn)動(dòng)性變化情況完全相反，暗示橫跨這兩個(gè)片段的α3(L30-L34)受到較大牽扯力作用，推測(cè)這可能是α3二級(jí)結(jié)構(gòu)最終被破壞的主要原因(圖4A，4C). 片段P61-H87運(yùn)動(dòng)性降低(圖4C)的原因則應(yīng)是因?yàn)樵撈沃行牡腇77與CTZ產(chǎn)生了較強(qiáng)結(jié)合能，導(dǎo)致周邊區(qū)域穩(wěn)定性提升所致(圖4B).

圖4 nanoKAZ-CTZ復(fù)合體內(nèi)各氨基酸殘基的結(jié)合能貢獻(xiàn)情況與nanoKAZ的主鏈運(yùn)動(dòng)性間的關(guān)系A(chǔ). 模擬開始前nanoKAZ的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布；B. nanoKAZ與CTZ的結(jié)合能分解圖示：能量大于2 kJ/mol的氨基酸殘基位點(diǎn)已被標(biāo)出，其中與底物形成穩(wěn)定氫鍵的兩氨基酸殘基Q12和V27下標(biāo)“HB”，右方插入小圖顯示殘基Q12和V27與CTZ間形成氫鍵隨模擬時(shí)間的變化情況；C. apo-nanoKAZ與nanoKAZ-CTZ在200 ns動(dòng)力學(xué)模擬期間氨基酸殘基RMSF的疊合圖譜. Fig. 4 The relationship between binding energy and backbone dynamics in the nanoKAZ-CTZ complex. A shows the secondary structure of nanoKAZ before simulation; B shows the binding energy contributes from all residues in the nanoKAZ-CTZ complex (residues contributing binding energy ≥2 kJ/mol are marked below, hydrogen bond forming residues Q12/V27 are further marked with “HB”), the inserted figure shows the hydrogen bond existence between Q12/V27 and CTZ during 200 ns simulation; C shows the overlapped residue RMSFs between nanoKAZ-CTZ and apo-nanoKAZ during 200 ns simulation.

nanoKAZ的分子結(jié)構(gòu)顯示片段L18-F31和片段P61-H87位于該蛋白中央疏水空腔的入口處. 在模擬過程中兩片段由于與CTZ存在結(jié)合能作用，其自身以及周邊片段均受到來(lái)自CTZ方向引力作用進(jìn)而發(fā)生位移. 200 ns模擬完成后nanoKAZ-CTZ的構(gòu)象顯示，片段L18-F31的接鄰片段V27-V38(含完整α3區(qū)域，其主鏈運(yùn)動(dòng)性受片段L18-F31影響)和片段P61-H87最終彼此靠攏并穩(wěn)定，將nanoKAZ的疏水腔入口關(guān)閉形成完全閉合的疏水空間(圖5).

圖5 200 ns模擬前后nanoKAZ-CTZ(不顯示CTZ結(jié)構(gòu))的結(jié)構(gòu)疊合情況，其中片段V27-V38與片段P61-H87被標(biāo)示并染色(模擬前兩片段為紅色，模擬后為青色)，方框內(nèi)小圖展示nanoKAZ在模擬前(A)與模擬后(B)內(nèi)部疏水腔(透明淡藍(lán)色顯示)表面的變化情況(兩圖觀察方向一致). Fig. 5 The superimposing of nanoKAZ-CTZ (CTZ removed) between those before and after 200 ns simulation. Fragments V27-V38 and P61-H87 are highlighted by cyan (before simulation) and red (after simulation), respectively. The inserted figures show the interior cavity (transparent light blue) of nanoKAZ between those before (A) and the after (B) 200 ns simulation in the same view direction.

此外，我們還發(fā)現(xiàn)nanoKAZ-CTZ復(fù)合體中三個(gè)片段較apo-nanoKAZ模擬時(shí)RMSD明顯增加：G48-N50、V98-P104和Y109-R112. 其中，片段G48-N50和V98-P104位于兩個(gè)短β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)上，距離底物較遠(yuǎn)，推測(cè)是底物的空間位阻對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)造成影響導(dǎo)致這兩個(gè)片段不穩(wěn)定性上升. 片段Y109-R112位于一個(gè)較長(zhǎng)的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，在主鏈運(yùn)動(dòng)過程中，片段Y109-R112有幾率與底物分子發(fā)生觸碰；且nanoKAZ-CTZ的結(jié)合能分解結(jié)果顯示殘基Y109，F(xiàn)110和R112與底物存在結(jié)合能作用. 從空間位置上看，片段Y109-R112正對(duì)底物分子中心雜環(huán)C3位的酮基氧原子(圖6)，有研究表明該原子為底物氧化反應(yīng)的初始位點(diǎn)[8, 14]，據(jù)此推測(cè)片段Y109-R112有可能輔助或直接參與底物的氧化催化反應(yīng).

圖6 模擬完成后CTZ(黃)與nanoKAZ形成的穩(wěn)定復(fù)合體，與底物形成氫鍵的Q12和V27用綠色標(biāo)示，片段Y109-R112用藍(lán)色標(biāo)示. Fig.6 The nanoKAZ-CTZ complex after 200 ns simulation. CTZ is colored yellow; residues Q12 and V27 that form hydrogen bonds with CTZ are colored green; the Y109-R112 loop with potential catalytic function is colored blue.

4 討 論

基于以上結(jié)果，我們對(duì)nanoKAZ和CTZ結(jié)合形成復(fù)合體的過程做出以下推測(cè)：CTZ進(jìn)入nanoKAZ空腔后，首先與位于β桶區(qū)域內(nèi)7個(gè)氨基酸殘基Q12，P40，I56，V58，L92，F(xiàn)151，C164發(fā)生作用，由于nanoKAZ的β折疊結(jié)構(gòu)具有高穩(wěn)定性，因此CTZ可以在其中調(diào)整取向并借由結(jié)合能穩(wěn)定在催化空腔中. 同時(shí)，CTZ與片段L18-F31，P61-H87發(fā)生作用，導(dǎo)致α3結(jié)構(gòu)被破壞形成loop區(qū)域同時(shí)兩片段借與CTZ產(chǎn)生的結(jié)合能作用關(guān)閉nanoKAZ的催化腔形成完全的疏水空間. 由于底物CTZ具有高疏水特性，因而能夠穩(wěn)定于該腔中被催化氧化. 有研究報(bào)道nanoKAZ相較其他CTZ熒光素酶具有更高的底物類似物催化活性[8]，推測(cè)這是由于CTZ與nanoKAZ結(jié)合后，封閉催化腔的α3區(qū)域形變?yōu)閘oop具有一定柔性，有效抵消了底物類似物中改變基團(tuán)在催化腔中的空間位阻，利于底物中心活性基團(tuán)與nanoKAZ的催化位點(diǎn)接觸.

另外，目前已有研究組通過定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)對(duì)nanoKAZ上的部分氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了突變研究，其結(jié)果顯示改變位于催化腔關(guān)閉功能片段L18-F31，P61-H87上的氨基酸殘基L18, S19, V27，S28，G67，G71，N85以及位于推測(cè)活性關(guān)聯(lián)片段Y109-R112上的 R112能夠大幅影響nanoKAZ的催化發(fā)光活性[15]，一定程度上支持了計(jì)算結(jié)果.

5 結(jié) 論

目前，以CTZ做為底物的酶催化發(fā)光反應(yīng)機(jī)制大多處于未知狀態(tài)，其主要原因是CTZ化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在酶催化下反應(yīng)極其迅速，難以對(duì)反應(yīng)中間體進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)測(cè)定. 本研究通過開展nanoKAZ與底物的分子對(duì)接及動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)，揭示了CTZ在進(jìn)入催化腔后分別與腔內(nèi)β桶區(qū)域，腔口柔性片段作用最終封閉催化腔以促進(jìn)催化反應(yīng)發(fā)生這一過程. 另外，模擬結(jié)果還顯示片段Y109-R112有可能參與催化反應(yīng). 該結(jié)果闡釋了nanoKAZ與底物的結(jié)合模式，為以后nanoKAZ的理性分子改造提供了理論基礎(chǔ).