石銘蕓, 范 榮, 盛 潔, 朱 濤, 蔣中英,

(1.伊犁師范大學 電子與信息工程學院 微納電傳感技術與仿生器械重點實驗室, 伊寧 835000; 2.南京大學 物理學院 固體微結構物理國家重點實驗室, 南京 210093)

1 前 言

抗菌肽是動物體內(nèi)抵御細菌的天然免疫工具[1], 具有重要的生物醫(yī)學研究價值. 蜂毒肽(melittin)是典型的陽離子兩親性抗菌肽[2], 能夠非特異性的靶并引發(fā)細菌死亡[3].

為理解蜂毒肽的靶向性殺傷機制, 需要理解蜂毒肽與不同生物膜作用的差異. 由于細胞細菌脂膜的復雜性, 常采用簡化的仿生磷脂囊泡[4], 以其內(nèi)含物的泄露來考查多肽的作用效果[5]. Lee[6]等發(fā)現(xiàn), 只有蜂毒肽在膜內(nèi)高于某臨界濃度時, 多肽才會與磷脂組裝成孔洞導致內(nèi)含物泄露. 元冰[7]等實驗發(fā)現(xiàn), 膜-肽作用受到膜組分相態(tài)[8]等多種因素[9]的影響. 當磷脂低于主轉變溫度, 蜂毒肽在膜表面成孔效率顯著降低. 同時, 牛葳[10]Russell[11]等認為負向膜電位磷脂會影響蜂毒肽的取向, 不易形成跨膜通道; 蜂毒肽可通過靜電引力競爭性取代二價鈣、鎂陽離子, 實現(xiàn)細胞膜的滲透作用. 這些研究表明了磷脂相態(tài)、電性[12]在調(diào)控肽-膜作用中的重要性. 但是, 早先研究常采用單一組分的磷脂膜開展研究, 真實生物膜組分的多樣性會如何影響肽-膜作用尚不清楚.

在本研究中, 我們利用熒光光譜等考察了蜂毒肽與單組分、多組分磷脂膜的作用機制. 結果表明, 對于不同電性與相態(tài)的單組分磷脂膜, 肽-膜作用呈現(xiàn)為穩(wěn)定桶板型孔、非穩(wěn)U型孔及變薄裂解等多種機制, 具有顯著不同的內(nèi)含物泄露效率. 對于多組分磷脂囊泡, 泄露性質(zhì)并不是每種組分泄露性質(zhì)的平均, 而主要取決于與肽具有較強親和性的組分. 研究深化了多肽與生物膜作用的理解, 為提升多肽載藥體系的釋控能力提供了參考.

2 實驗部分

2.1 材 料

二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、二油?；字＝z氨酸(DOPS)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)購于Avanti Polar Lipids. 蜂毒肽、DOPE-Rhodamine B購于Aladdin(分子結構如圖1). 熒光染料為鈣黃綠素, Triton TM X-100購于百靈威.

圖1 蜂毒肽與DOPC、DOPS和DPPC. (a)蜂毒肽氨基酸序列. 蜂毒肽是正電性兩親多肽; 與膜結合后, 呈α-螺旋結構. (b)DOPC與DPPC為雙電性磷脂, 在25 ℃分別為液相和凝膠相; DOPS為負電性磷脂.Fig. 1 Melittin and DOPC, DOPS and DPPC. (a) Amino acid sequence of melittin. melittin is a positively charged amphiphilic peptide, which transforms to α-helix when interacts with membrane. (b) DOPC and DPPC are zwitterionic phospholipids, which are in liquid and gel phases at 25 ℃, respectively. DOPS is a negatively charged phospholipid.

2. 2 囊泡制備

囊泡通過擠出法制備[13], 先用氮氣流干燥混合于氯仿溶液中的磷脂使其成膜, 真空干燥6小時后加入鈣黃綠素溶液(10 mM Tris, 50 mM 鈣黃綠素, 375 mM 蔗糖, pH = 7. 4)水化形成多層囊泡, 通過聚碳酸酯膜擠出器(100 nm孔徑濾膜)循環(huán)擠壓20次獲得單層囊泡. 使用Sephadex G-25凝膠過濾柱層析(GE Healthcare Life Sciences)除去未被包封的熒光染料[14].

2. 3 熒光光譜檢測囊泡內(nèi)熒光染料的泄露

通過Perkin Elmer LS55熒光光譜儀檢測多肽誘導的鈣黃綠素泄漏. 激發(fā)波長為488 nm, 發(fā)射波長為518 nm. 制備囊泡包裹的高濃度染料發(fā)生自猝滅. 逐漸滴加蜂毒肽導致膜雙層結構受損, 熒光染料從囊泡中泄出稀釋于外部溶液, 熒光強度增強. 基于熒光強度的變化量獲取泄露百分比(Leakage%)：Leakage%=[(F-FB)×100]/(FD-FB), 其中F、FB分別是添加多肽之后、之前的熒光強度,FD是使用100%泄漏的熒光強度(Triton滴定實現(xiàn))[15]. 所有實驗均在室溫下( 25 ℃ )進行.

2.4 熒光光譜檢測蜂毒肽與生物膜的結合

使用Perkin Elmer LS55檢測蜂毒肽在不同磷脂囊泡表面的吸附量. 蜂毒肽中色氨酸殘基的自發(fā)熒光受周邊介質(zhì)環(huán)境的影響. 設定激發(fā)波長為280 nm, 當肽與生物膜結合時, 熒光發(fā)射峰由352 nm向336 nm[16]紅移. 基于兩波長的熒光強度的比值(F336/F352)表征蜂毒肽與不同脂膜的結合量.

2.5 膜-肽作用的顯微觀測

將DOPE-Rhodamine B(RhB-PE)標記的不同脂質(zhì)組分囊泡與蜂毒肽溶液在體相中共培養(yǎng)2 min, 置于全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF, Olympus)下觀察(100倍油鏡, 543 nm激光器, Andor 897 EMCCD). 使用cellSens Dimension軟件采集圖像. 加入蜂毒肽前, 首先采集囊泡與肽作用圖像. 加入蜂毒肽作用3 min后(肽濃度為8.7 μmol/L), 再次采集囊泡與肽作用圖像.

3 結果與討論

3. 1 單組分脂質(zhì)體的肽致泄露

首先, 我們表征了蜂毒肽引起的DOPC、DOPS及DPPC磷脂囊泡中的熒光染料鈣黃綠素的泄露. 對于DOPC(圖2a), 滴加三次蜂毒肽后熒光強度開始提高, 說明達到了泄露的臨界肽脂比(P/Ls= 0.03, 熒光染料開始泄露). 隨著蜂毒肽的繼續(xù)加入, 樣品熒光逐漸增強. 直到肽脂比(P/L)達到0. 11, 后續(xù)的肽滴加無法造成熒光強度的繼續(xù)提高, 說明達到了泄露的飽和肽脂比(P/Lo= 0.11, 熒光染料泄露極限). 加入Triton使囊泡解體, 發(fā)現(xiàn)熒光強度未進一步提高, 說明蜂毒肽實現(xiàn)了熒光染料的完全泄露. Alexandre[17]等計算機模擬研究發(fā)現(xiàn), PC極性頭與陽離子性蜂毒肽存在靜電排斥, 蜂毒肽插入雙層, 以桶板型與膜作用[18](圖3), 可實現(xiàn)高效的蜂毒肽打孔與內(nèi)含物的泄露. 這與我們實驗觀測的現(xiàn)象是一致的.

圖2 (a-c) 蜂毒肽導致的囊泡內(nèi)熒光染料泄露曲線. 間隔的熒光強度波動代表著蜂毒肽的逐漸滴入與肽濃度的提高. (d) 給定P/L下的平均泄露量, slope為曲線的線性擬合斜率.Fig. 2 (a-c) Melittin-induced fluorescent dye leakage in vesicles. The intermittent fluctuation of fluorescence intensity represents the gradual dripping of melittin and the increase of peptide concentration. (d) Average leakage at given P/L and its linear fitted slopes.

蜂毒肽也可造成DPPC囊泡中熒光染料的泄露. 但相較于DOPC, DPPC的P/Ls與P/Lo分別提高了67%和55%(圖2b), 表明DPPC囊泡的泄露顯著慢于DOPC. 圖2d展示了給定P/L下的平均泄露量(三次重復實驗獲得)與它們的線性擬合斜率(slope).DPPC實驗的slope較DOPC下降37. 8%, 即脂膜的相態(tài)影響了膜-肽的作用. Kolattukudy[19]等分子動力學模擬(MD)研究發(fā)現(xiàn), 流動性差的DPPC凝膠相囊泡會影響多肽分子在膜表面的組裝, 產(chǎn)生不穩(wěn)定的U形構象孔隙, 囊泡內(nèi)含物泄露速率較低. 同時, 圖2b展示了蜂毒肽無法實現(xiàn)DPPC囊泡中熒光染料的完全泄露. 這可能是由于多肽與DPPC在孔隙處形成膠束[20], 阻礙了泄露(圖3).

圖3 DOPC、DOPS和DPPC囊泡與蜂毒肽的作用示意圖Fig. 3 Schematic diagram of the interactions between melittin and DOPC, DOPS, DPPC vesicles.

相較于DOPC, DOPS的P/Ls與P/Lo值提高了一個量級(圖2c), 與Geert[21]的報道基本一致. 進一步發(fā)現(xiàn), DOPS囊泡的泄露過程呈現(xiàn)為兩個顯著差異的階段(圖2d). 階段一(P/L在0.28～0.56), 泄漏量隨多肽加入緩慢提高,slope為 0. 617; 階段二(P/L在0.56～1.53), 泄漏量隨多肽加入快速拉升,slope為1. 379. 這可能源于DOPS膜與蜂毒肽結合復雜的中間過程. 由于靜電吸引, 蜂毒肽往往平鋪在DOPS膜表面, 在低濃度下無法形成穩(wěn)定的孔洞[22], 對應較低的slope; 直到較高濃度的多肽會對膜結構強烈的干擾(磷脂間拉伸和膜變薄), 膜的裂解造成內(nèi)含物的完全泄露[23](圖3), 造成較高的slope.

3. 2 二元混合組分脂質(zhì)體的肽致泄露

隨后, 選用二元脂質(zhì)DOPC/DPPC(1:1)和DOPC/DOPS(1:1), 觀測蜂毒肽造成它們包裹的熒光染料泄露. 如圖4b所示, DOPC/DPPC的P/Ls和P/Lo分別為0. 03、0. 08. 顯著性差異分析表明, 相較于DPPC(P/Ls=0.05,P/Lo=0.17), DOPC(P/Ls=0.03,P/Lo= 0.11)與DOPC/DPPC(1:1)的P/Ls及P/Lo值差異性較低(圖4ef), 表明后兩者的肽致泄露性質(zhì)相似. 如混合組分的泄露性質(zhì)是每種組分泄露性質(zhì)的平均, 則DOPC/DPPC(1:1)的P/Ls、P/Lo應為0.04、0.14, 這與實驗獲得的數(shù)值并不相符. 為理解該現(xiàn)象, 通過熒光光譜的F336/F352表征了DOPC、DPPC磷脂囊泡上蜂毒肽的吸附量. 由圖4a所示, 隨著P/L的提高, DOPC的F336/F352快速增長并最終平衡在0. 98, 表明綁定在膜表面的蜂毒肽含量提高并逐漸飽和. 相較于DOPC, DPPC的F336/F352增長較慢, 平衡值較低(0. 947), 表明DPPC對蜂毒肽的結合能力低、親和力弱. DPPC脂膜中分子間范德華疏水作用較強[24], 磷脂排布較緊密, 不利于兩親性蜂毒肽的結合. 因此蜂毒肽更利于與DOPC組裝, 導致DOPC/DPPC表現(xiàn)出與純DOPC囊泡相近的泄露性質(zhì).

而相較于DOPC, DOPC/DOPS(1:1)的P/Ls與P/Lo分別提高一個量級以上. 顯著性差異分析表明, DOPC/DOPS(1:1)與DOPS的泄露性質(zhì)差異性較低(圖4c). 并且, DOPC/DOPS的泄露呈現(xiàn)為三個顯著差異的階段, 分別對應著slope 0. 072、1. 47、0. 54, 說明DOPC/DOPS的泄露是多階段過程(圖4d), 也與DOPS相似. 繼而表征了DOPC與DOPS磷脂囊泡表面的蜂毒肽吸附量. 由圖4a所示, 相較DOPC, DOPS脂膜上蜂毒肽吸附更快, 平衡吸附量更大. 在實驗pH值下, DOPC的兩性離子頭基顯電中性, 而DOPS的負電性頭基顯負一價. 由于靜電吸引, 后者更易與正電性的蜂毒肽分子結合. 因此蜂毒肽更利于與DOPS組裝, 導致DOPC/DOPS表現(xiàn)出與純DOPS囊泡相近的泄露性質(zhì).

3. 3 DOPC/DOPS(1:1)囊泡的膜-肽作用觀察

圖5展示了RhB-PE標記的DOPC、DOPS以及DOPC/DOPS(1:1) LUVs模型與蜂毒肽作用前后的熒光顯微鏡圖. 加入蜂毒肽之后, DOPC囊泡尺寸無明顯變化, 表明DOPC采用對脂膜完整性影響較小的成孔機制, 造成內(nèi)含物泄露; 而對于DOPS及DOPC/DOPS(1:1)囊泡, 蜂毒肽的加入均造成了它們尺寸的顯著提高, 表明結合蜂毒肽導致了它們內(nèi)部磷脂間的拉伸與表面積增大. 這驗證了膜變薄導致的膜失穩(wěn)在后兩者內(nèi)含物泄露的重要作用.

圖4 (a-b)蜂毒肽導致的囊泡內(nèi)熒光染料泄露曲線. (c) 給定P/L下的平均泄露量. (d-e) 單組分與混合組分囊泡的P/Ls 和P/Lo顯著性差異分析(p值通過t檢驗獲得：ns p> 0.05, * p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001). (f) 基于F336/F352表征蜂毒肽在DOPC、DPPC、DOPS膜表面的吸附量.Fig. 4 (a-b) Melittin-induced leakage curve of fluorescent dyes in vesicles. (c) Average leakage at a given P/L. (d-e) Statistical significance analysis of P/Ls and P/Lo values (p value was calculated using multiple t-test：ns p> 0.05, * p< 0.05, **p< 0.01, ***p< 0.001). (f) Attachment of melittin to DOPC, DPPC, and DOPS membranes characterized by F336/F352.

圖5 DOPC、DOPS和DOPC/DOPS(1:1) LUV與肽作用的熒光顯微圖像. 左側圖像為作用前的囊泡, 右側圖像為作用后的囊泡.Fig. 5 Fluorescence microscopic images of the interactions between melittin and DOPC, DOPS, and DOPC/DOPS (1:1) vesicles. The left and right images display the vesicles before and after the addition of peptides.

4 結 論

在本研究中, 我們利用熒光光譜考察了蜂毒肽與仿生磷脂膜的作用機制. 單組分磷脂囊泡的泄漏實驗表明, 蜂毒肽與不同相態(tài)、電性的生物膜作用機制是具有顯著區(qū)別的：在液晶雙電性磷脂膜中, 出現(xiàn)桶板型孔洞, 實現(xiàn)高效的泄露; 在凝膠相雙電性磷脂膜中, 產(chǎn)生不穩(wěn)定的U形孔隙, 囊泡內(nèi)含物的泄露速率較低; 在負電性磷脂膜中, 呈現(xiàn)了肽平鋪與膜變薄裂解兩個作用階段, 多肽導致的泄露最低效. 多組分磷脂囊泡的泄露實驗表明, 泄露由肽親和性較強的磷脂組分決定. 液晶-凝膠相混合磷脂囊泡中, 液相磷脂與肽的親和性強, 混合組分膜與純液相磷脂膜的泄露效率相近; 雙電性-負電性混合磷脂囊泡中, 負電性磷脂與肽的親和性強, 混合組分膜與純負電性磷脂膜的泄露效率相近. 研究深化了多肽與生物膜作用的理解, 為提升多肽載藥體系的釋控能力提供了參考.