劉秀娟 吳 豫 鄒 鑫 余燕燕 耿燕秋 雙 峰

1.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院腎內(nèi)科，江西南昌 330002；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院檢驗科，江西南昌 330002；3.解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學中心腎內(nèi)科，北京 100039；4.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇八醫(yī)院骨科，江西南昌 330002

他索沙坦是一種血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）受體拮抗劑，在臨床上用于降低患者血壓，消除體內(nèi)炎癥[1]。Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是介導腎臟炎癥及纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，Ang Ⅱ能夠促進腎小管上皮細胞中TLR4 的表達[2-4]。作為Ang Ⅱ受體拮抗劑的他索沙坦可能通過抑制TLR4 對腎臟纖維化起到調(diào)控作用。缺氧缺血是腎臟纖維化中導致細胞凋亡和炎癥反應的重要原因之一[5-7]。糖氧剝奪細胞模型多被用于在細胞水平上模擬缺氧缺血損傷的過程，應用此模型可進行藥物保護作用機制的研究[8-10]。本研究探討他索沙坦對人腎小管上皮細胞（HK-2）損傷的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

HK-2 細胞購于美國模式培養(yǎng)物保藏所；他索沙坦（貨號：B-WM831）購于上海賢鼎生物科技有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ，ColⅠ）、纖維粘連蛋白（Fibronectin）、E 鈣粘蛋白（E-cadherin）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（C/EBPhomologousprotein，CHOP）、TLR4 和β 肌動蛋白（β-actin）一抗（貨號分別為19245、72026、26836、8426、3177、D46F1、143585、8480），二抗（貨號：704S）均購于美國Santa Cruz 公司；pcDNA3.1-TLR4 和空載質(zhì)粒購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 HK-2 細胞培養(yǎng)于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中。對照組為正常培養(yǎng)的細胞；糖氧剝奪組細胞培養(yǎng)于不含血清的無糖培養(yǎng)基，放置于2% O2，93% N2，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；糖氧剝奪組的細胞培養(yǎng)液中加入終濃度分別為1、5、10、15 μmol/L 的他索沙坦進行培養(yǎng)組成不同濃度的他索沙坦藥物組。培養(yǎng)48 h 后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞增殖檢測 細胞增殖檢測采用MTT 法，操作步驟按照試劑盒說明書進行，用酶標儀測定490 nm的吸光度（optical density，OD）值。細胞增殖率=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）。

1.2.3 細胞凋亡檢測 HK-2 細胞分組處理48 h 后，用4℃預冷的PBS 將各組細胞洗滌2 次，隨后加入含0.2% EDTA 的胰酶消化并收集細胞。加入1 ml 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液，800 r/min 離心5 min 后棄上清，加入200 μl 結(jié)合緩沖液重懸細胞。懸液中加入5 mg/L 的Annexin V-FITC 10 μl 和碘化丙啶5 μl，混勻后37℃避光孵育30 min。最后以488 nm 為激發(fā)波長，530 nm 為發(fā)射波長，用流式細胞儀（Attune NxT，Thermo Fisher）檢測細胞凋亡。

1.2.4 Western blot 實驗 HK-2 細胞分組處理48 h后，用RIPA 細胞蛋白裂解液裂解各組細胞，提取細胞總蛋白，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。以β-actin 為內(nèi)參，同等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，進行電轉(zhuǎn)膜，加入待測蛋白一抗，4℃孵育過夜。漂洗后加入二抗，室溫孵育1 h。用X 線曝光分析，結(jié)果用Image-Pro Plus 處理。

1.2.5 TLR4 過表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期生長良好的HK-2 細胞，用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 將TLR4 的過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-TLR4 或?qū)φ湛蛰d質(zhì)粒pcDNA3.1 轉(zhuǎn)染細胞48 h。Tas+pcDNA3.1-TLR4組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TLR4 質(zhì)粒后，細胞培養(yǎng)液中加入10 μmol/L 的他索沙坦并用糖氧剝奪培養(yǎng)；Tas+pcDNA3.1組：轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒后，細胞培養(yǎng)液中加入10 μmol/L 的他索沙坦并用糖氧剝奪培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad prism 5 軟件統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用Bonferroni 檢驗。以P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 他索沙坦對糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞增殖的影響

糖氧剝奪組的細胞增殖率低于對照組（P ＜0.05）。1、5、10 μmol/L 他索沙坦組與糖氧剝奪組細胞增殖率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。15 μmol/L 他索沙坦組細胞增殖率低于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。后續(xù)實驗中選取10 μmol/L 他索沙坦作為糖氧剝奪HK-2細胞的處理濃度。見圖1。

圖1 他索沙坦對糖氧剝奪誘導HK-2 細胞增殖的影響

2.2 他索沙坦對糖氧剝奪誘導HK-2 細胞凋亡的影響

糖氧剝奪組細胞凋亡率高于對照組（P ＜0.05）。他索沙坦組細胞凋亡率低于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 他索沙坦對糖氧剝奪誘導HK-2 細胞凋亡的影響

2.3 他索沙坦對糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞腎纖維化標志蛋白表達的影響

糖氧剝奪組α-SMA、ColⅠ和Fibronectin 蛋白表達高于對照組，E-cadherin 蛋白表達低于對照組（P ＜0.05）；他索沙坦組α-SMA、ColⅠ和Fibronectin蛋白表達低于糖氧剝奪組，E-cadherin 蛋白表達高于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 他索沙坦對糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞腎纖維化標志蛋白表達的影響

2.4 他索沙坦對糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

糖氧剝奪組GRP78 和CHOP 蛋白表達高于對照組（P ＜0.05）；他索沙坦組GRP78 和CHOP 蛋白表達低于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。見圖4。

圖4 他索沙坦對糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

2.5 TLR4 過表達對他索沙坦減緩糖氧剝奪誘導HK-2 細胞損傷的影響

糖氧剝奪組TLR4 蛋白表達高于對照組（P ＜0.05）；他索沙坦組TLR4 蛋白表達低于糖氧剝奪組（P ＜0.05）。他索沙坦+pcDNA3.1-TLR4 組TLR4 表達高于他索沙坦組，細胞凋亡率高于他索沙坦組，α-SMA、ColⅠ、Fibronectin、GRP78 和CHOP 蛋白表達高于他索沙坦組，E-cadherin 蛋白表達低于他索沙坦組（P ＜0.05）。見圖5。

圖5 他索沙坦通過抑制TLR4 表達對糖氧剝奪誘導HK-2 細胞損傷的影響

3 討論

臨床上常用血管緊張素受體拮抗劑改善慢性腎病患者的病情，但是其治療原理還未完全闡明[11-12]。他索沙坦是血管緊張素受體拮抗劑之一。本研究結(jié)果顯示，糖氧剝奪處理顯著抑制HK-2 細胞的生長，低濃度的他索沙坦對糖氧剝奪處理的HK-2 細胞沒有毒性作用，本研究挑選了10 μmol/L 他索沙坦作為最適的處理濃度。他索沙坦抑制糖氧剝奪誘導的HK-2細胞凋亡。研究中常用α-SMA、ColⅠ、Fibronectin 和E-cadherin 作為組織纖維化的檢測指標[13]。本研究結(jié)果顯示，他索沙坦顯著抑制糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞中α-SMA、ColⅠ和Fibronectin 的蛋白表達，并促進E-cadherin 的蛋白表達。提示他索沙坦能夠抑制糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和多種腎臟疾病的發(fā)展緊密相關(guān)[14-16]。GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激系統(tǒng)上游的開關(guān)分子[17-19]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)分子[20-22]。本研究結(jié)果顯示，他索沙坦顯著抑制糖氧剝奪誘導HK-2 細胞中GRP78 和CHOP 的蛋白表達，提示他索沙坦有抑制糖氧剝奪誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的潛力。

腎臟纖維化的過程中伴隨著持續(xù)的炎癥[23]。TLR4作為炎癥的重要調(diào)節(jié)因子，在腎病患者的病變組織、各類腎臟纖維化動物模型中呈現(xiàn)過量表達，成功抑制或敲除TLR4 可以減輕腎臟纖維化[24-25]。本研究結(jié)果顯示，糖氧剝奪組TLR4 表達顯著高于對照組，他索沙坦顯著抑制了糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞中TLR4的表達。過表達TLR4 后他索沙坦處理引起細胞凋亡減少，腎臟纖維化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記蛋白表達降低的作用被減弱，提示他索沙坦減緩糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞損傷的作用是通過抑制TLR4 產(chǎn)生的。

綜上所述，他索沙坦能夠抑制糖氧剝奪誘導的HK-2 細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，且其作用是通過抑制TLR4 的表達產(chǎn)生的，這些結(jié)果為今后他索沙坦在腎臟纖維化疾病治療中的應用提供新的實驗證據(jù)。