張帆帆，涂凌云，李海琴，曾艷兵，康昭風(fēng)，譚美芳，譚 佳，方紹培，楊 群*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.南昌市動物疫病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330008)

禽白血病(avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)引起的一種呈世界性分布的禽類傳染病，能夠垂直和水平方向傳播，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中可導(dǎo)致雞產(chǎn)生腫瘤、免疫抑制、生產(chǎn)性能下降甚至死亡等，被列為國家中長期動物疫病規(guī)劃(2012-2020)的3大禽病之一[1-4]。根據(jù)病毒囊膜蛋白的特性，目前雞的ALV共分為7個(gè)亞群(A、B、C、D、E、J和K)，其中ALV-J是當(dāng)前最為流行、致病性最強(qiáng)的ALV。自1999年在我國發(fā)現(xiàn)以來，我國肉雞、蛋雞及地方品種雞群中普遍存在ALV-J的感染，對我國家禽種質(zhì)資源的安全構(gòu)成極大威脅，也給行業(yè)養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1,5-6]。迄今為止，ALV-J無有效的疫苗和藥物，控制ALV-J的主要方法是淘汰陽性雞、凈化雞群。本文對ALV的基因組特征、病毒復(fù)制、致瘤機(jī)制、免疫抑制機(jī)制及宿主天然抗病毒過程的分子機(jī)制等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 ALV-J基因組特征

ALV-J屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科正反轉(zhuǎn)錄病毒亞科α反轉(zhuǎn)錄病毒屬成員，為有囊膜單股正鏈線性的RNA二聚體病毒。病毒基因組不能作為mRNA翻譯蛋白質(zhì)，需反轉(zhuǎn)錄成前病毒整合到宿主細(xì)胞基因組，利用宿主細(xì)胞的細(xì)胞器及酶系統(tǒng)完成病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯和組裝[7]。病毒基因組全長約7.2～7.9 kb，兩端包含2個(gè)非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)，中間包含3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白基因gag、pol、env，基因組結(jié)構(gòu)為5′-UTR-gag-pol-env-UTR-3′。病毒基因組由RNA反轉(zhuǎn)錄到DNA前病毒過程中在基因組兩端分別添加U3和U5，構(gòu)成長末端重復(fù)序列(long terminal repeats，LTR)，形成5′-LTR-gag-pol-env-LTR-3′基因組結(jié)構(gòu)(圖1)[8]。以馬立克氏病病毒(marek’s disease virus，MDV)作為CRISPR/Cas9遞送系統(tǒng)靶向ALV-J基因組的5′LTR，可有效地破壞潛伏整合的病毒基因組，并為細(xì)胞提供防御新ALV-J感染的能力[9]。gag基因編碼病毒的多聚前體蛋白Pr76，在病毒天冬氨酸蛋白酶P15的切割下形成6種非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白，包括基質(zhì)蛋白P19、P2、P10、衣殼蛋白P27、核衣殼蛋白P12、蛋白酶P15[10-11]，其中衣殼蛋白P27的氨基酸序列高度保守，為群特異性抗原[12-13]；pol基因編碼病毒的反轉(zhuǎn)錄酶p68和整合酶p32；env基因編碼病毒的囊膜糖蛋白SU表面蛋白(gp37)和TM跨膜蛋白(gp85)，主要決定病毒的宿主范圍，并與病毒的致瘤性相關(guān)[14-16]。

圖1 ALV-J前病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖

2 病毒的復(fù)制

ALV-J的復(fù)制過程主要包括吸附、穿入、脫殼、生物合成、組裝成熟和釋放。病毒粒子以囊膜表面蛋白與雞Na+/H+交換Ⅰ型跨膜細(xì)胞表面蛋白(chicken Na+/H+exchanger typeⅠ，chNHE1)/雞ANXA2(chicken annexin A2，chANXA2)受體結(jié)合介導(dǎo)ALV-J與宿主細(xì)胞的吸附(圖2)，在吸附過程中病毒囊膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，在輔助受體或內(nèi)體的幫助下病毒核心粒子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，完成脫衣殼[17-18]。研究表明，ALV-J gp85的兩段序列基序(38～131 aa和159～283 aa)是與chNHE1結(jié)合所必需的，其2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(N6和N11)和2個(gè)半胱氨酸(C3和C9)在病毒與受體結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞過程起著至關(guān)重要的作用[15]。研究人員利用CRISPR/Cas9對雞胚胎原始生殖細(xì)胞進(jìn)行編輯，成功制備了缺失chNHE1基因的基因編輯雞，研究結(jié)果表明，同野生型雞相比，chNHE1缺失的雞沒有表現(xiàn)出任何明顯的副作用，并對ALV-J具有較強(qiáng)的抵抗能力[19-20]。脫殼完成后，病毒RNA在自身逆轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA，與整合酶等多種病毒蛋白及宿主蛋白共同形成整合前復(fù)合體(pre-initiation-complex，PIC)，PIC入核后在整合酶的作用下整合進(jìn)入宿主基因組形成前病毒，經(jīng)宿主細(xì)胞RNA聚合酶作用轉(zhuǎn)錄形成新的RNA，合成各種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，組裝后出芽釋放成熟的子代病毒粒子[21]。

3 病毒的致病機(jī)理

3.1 ALV-J致瘤機(jī)制ALV主要通過癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和插入突變兩種機(jī)制啟動癌基因的表達(dá)而使易感細(xì)胞和組織發(fā)生轉(zhuǎn)化致瘤。其中以啟動病毒癌基因?yàn)榛A(chǔ)的機(jī)制稱為癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，病毒感染機(jī)體細(xì)胞后導(dǎo)入癌基因，幾天或幾周內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成腫瘤，又稱為急性轉(zhuǎn)化型[22]；以啟動細(xì)胞癌基因?yàn)榛A(chǔ)的機(jī)制稱為插入突變機(jī)制，病毒不攜帶癌基因，病毒感染機(jī)體細(xì)胞后將前病毒插入至宿主細(xì)胞原癌基因或其周圍，間接激活染色體基因組中的原癌基因，與癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相比，這一機(jī)制的致瘤潛伏期較長[23]。ALV-J病毒主要通過LTR插入突變機(jī)制，當(dāng)前病毒插入在原癌基因上游，LTR中啟動子誘導(dǎo)原癌基因的非正常表達(dá)，稱為啟動子激活；當(dāng)前病毒插入在原癌基因附近，使增強(qiáng)子激活而誘導(dǎo)原癌基因過表達(dá)，稱為增強(qiáng)子激活[24]；前病毒插入在原癌基因中，LTR中的啟動子啟動病毒轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而啟動原癌基因轉(zhuǎn)錄稱為轉(zhuǎn)錄不終止激活。

不同于其他亞群的ALV，ALV-J主要誘發(fā)機(jī)體淋巴細(xì)胞瘤白血病，其還可誘發(fā)雞只骨髓細(xì)胞樣腫瘤、血管瘤、肝細(xì)胞癌和其他惡性腫瘤[24-26]。研究者利用ALV-J HB2009毒株感染雞只并觀察至20周齡，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤病例最早見于13周齡，并且還出現(xiàn)血管瘤的特征，在腦組織中檢測到瘤細(xì)胞，推測瘤細(xì)胞可能通過血腦屏障或骨膜浸潤到腦組織[27]。通過對比ALV-J HPRS-103毒株和A亞群RAV-1毒株發(fā)現(xiàn)，ALV-J誘導(dǎo)的髓系白血病與病毒對粒單核細(xì)胞的嗜性相關(guān)，其感染后誘導(dǎo)粒細(xì)胞的原癌基因c-myc激活而轉(zhuǎn)化成瘤細(xì)胞；感染RAV-1毒株的雞只法氏囊內(nèi)病毒基因表達(dá)水平較高，而感染HPRS-103毒株的雞只則沒有表達(dá)，這可能是HPRS-103毒株不能誘導(dǎo)淋巴白血病的原因[28]。另外，各種致癌因子的協(xié)同作用失衡也可引起機(jī)體形成腫瘤，感染ALV-J NX0101毒株的肉雞延髓、肝臟和肺組織p53相關(guān)腫瘤基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高，促進(jìn)腫瘤的形成[29-30]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小分子RNA在腫瘤的形成過程中同樣具有重要的作用。gga-miR-221和gga-miR-222等相關(guān)基因能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、周期進(jìn)程及遷移能力，同時(shí)也會抑制細(xì)胞凋亡[31]。microRNAs(miRNAs)的異常表達(dá)與ALV-J引起的肝癌進(jìn)展有關(guān)。為了探索對相關(guān)病理機(jī)制及病毒和宿主的相互作用，研究人員選擇了7個(gè)先前報(bào)道的miRNAs，通過比較分析感染和未感染DF-1 的細(xì)胞miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)6種與腫瘤發(fā)生有關(guān)的miRNAs(let-7b/7i、miR-221/222、miR-125b和miR-2127)均出現(xiàn)上調(diào)，表明這些miRNA可能在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[32]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA，具有高度保守和穩(wěn)定的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，在多種生物過程和疾病發(fā)生中起著重要作用。試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，感染組和對照組之間circRNA_3079的含量差異顯著，而且circRNA_3079及其預(yù)測的靶基因在許多與免疫或腫瘤相關(guān)的信號通路中富集，如p53信號通路、JAK-STAT信號通路、NOD樣受體信號通路等，說明circRNA_3079可能通過調(diào)控靶基因間接調(diào)控ALV-J誘導(dǎo)的腫瘤形成[33]。

3.2 ALV-J免疫抑制機(jī)制ALV-J誘導(dǎo)的免疫抑制能夠影響雞的生長和疫苗免疫應(yīng)答水平，并造成其他病原的繼發(fā)感染。目前已知ALV-J引起的免疫抑制主要包括：引起骨髓組織發(fā)生病變進(jìn)而導(dǎo)致T、B淋巴細(xì)胞減少；引起胸腺、法氏囊等淋巴細(xì)胞凋亡或壞死，使得T、B淋巴細(xì)胞的分化成熟受阻；引起外周免疫器官(如脾臟)發(fā)生病變，致使成熟淋巴細(xì)胞減少，使機(jī)體體液和細(xì)胞免疫及非特異性免疫水平下降。在感染過程中，ALV-J使淋巴濾泡中淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞喪失了產(chǎn)生IgG的能力，僅能產(chǎn)生IgM，而抗原特異性體液反應(yīng)的產(chǎn)生需要B細(xì)胞和T細(xì)胞相互協(xié)調(diào)。研究者用ALV-J先天感染模型，從形態(tài)和功能兩個(gè)方面研究ALV-J先天感染B細(xì)胞及其前體細(xì)胞的發(fā)育、分化和免疫功能，發(fā)現(xiàn)與早期感染雞只相比，先天性ALV-J感染導(dǎo)致了嚴(yán)重的免疫耐受，免疫器官特別是法氏囊發(fā)育不良，雞的IgM和IgG陽性細(xì)胞和總免疫球蛋白水平顯著降低，通過流式細(xì)胞分析證實(shí)，ALV-J阻斷了法氏囊CD117chB6 B細(xì)胞前體細(xì)胞的分化，B細(xì)胞及其祖細(xì)胞的體液免疫和免疫能力都受到了顯著地抑制[34]。朱麗君等[35]將ALV-J接種1日齡和7日齡SPF雛雞，研究不同感染時(shí)間對機(jī)體的免疫器官、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞等的影響，發(fā)現(xiàn)1日齡感染組中樞器官等免疫器官抑制程度顯著高于7日齡感染組，CD4+細(xì)胞數(shù)量明顯下降，而CD8+細(xì)胞數(shù)量明顯升高；而通過不同途徑接種SPF雛雞，除生長性能和免疫器官指數(shù)下降外，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和細(xì)胞因子的分泌量(IL-2、IL-4、IFN-γ)顯著降低，腹腔和肌肉注射組降低的最明顯。

ALV-J的TM區(qū)是引起機(jī)體誘發(fā)免疫抑制的主要因素。ALV-J的TM中存在一段高度保守的免疫抑制序列，亦稱為免疫抑制區(qū)(ISU)。該區(qū)域合成的多肽可在體內(nèi)外抑制淋巴細(xì)胞的活性，通過比較不同毒株發(fā)現(xiàn)，保守序列編碼的多肽的抑制活性與毒株種類無關(guān)。通過對ISU進(jìn)行氨基酸三級結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域可形成一個(gè)獨(dú)特的α螺旋，可與胞外片段內(nèi)的抗體反應(yīng)區(qū)(ARD)產(chǎn)生強(qiáng)烈的相互作用，而ISU和ARD之間相互協(xié)調(diào)的平衡關(guān)系可能就是免疫抑制發(fā)生的關(guān)鍵[36-38]。臨床上ALV-J常和其他病原混合感染引發(fā)機(jī)體更為明顯的免疫抑制。在ALV與禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(REV)共感染的蛋雞病例中發(fā)現(xiàn)一種少見的細(xì)胞類型，介于原淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間(稱為淋巴-巨噬細(xì)胞)，這可能是ALV-J與REV相互促進(jìn)、協(xié)同作用的結(jié)果。通過對ALV-J和REV感染CEF細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TRIM62調(diào)控微絲細(xì)胞骨架在共感染機(jī)制中起重要作用[39]。目前，對ALV-J引起的免疫抑制的防治雖取得了一定的進(jìn)步，但是仍無有效藥物或疫苗，其根本原因在于病毒靶向機(jī)體免疫系統(tǒng)并導(dǎo)致其損傷或無能。為此，需要在明確ALV-J誘導(dǎo)免疫抑制機(jī)制的同時(shí)，尋找減輕或消除機(jī)體免疫抑制的方法，是有效防治其危害的根本途徑。

4 抗ALV-J天然免疫及其病毒靶點(diǎn)

病毒感染后，宿主細(xì)胞通過宿主不同類型的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)感知具有病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的病毒以及病毒產(chǎn)物的存在，觸發(fā)不同的信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN或免疫相關(guān)因子抵抗病毒感染，激活相關(guān)免疫途徑，抑制病毒復(fù)制(圖2)。病毒與機(jī)體之間的進(jìn)化導(dǎo)致了細(xì)胞先天性免疫蛋白和抗病毒因子的出現(xiàn)。通過研究發(fā)現(xiàn)，許多被確定為抑制特定逆轉(zhuǎn)錄病毒的限制因子對其他逆轉(zhuǎn)錄病毒也具有廣泛的抗病毒活性，并且在多種病毒與宿主的相互作用下適應(yīng)性進(jìn)化，構(gòu)成了抵御病毒攻擊的先天免疫系統(tǒng)[21]。一方面，限制因子通過干擾病毒復(fù)制所需的細(xì)胞過程實(shí)現(xiàn)抗病毒。不育-α-基序結(jié)構(gòu)域(SAM域)和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)域(HD域)包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine-aspartic acid domain-containing protein 1，SAMHD1)通過其水解酶功能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脫氧核苷三磷酸(dNTPs)水平，抑制髓系和樹突狀細(xì)胞中病毒的復(fù)制，并限制CD4+T細(xì)胞對病毒的抑制作用[40]。當(dāng)骨髓細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞缺失SAMHD1時(shí)，病毒逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加，并觀察到的SAMHD1在殘基T592處的磷酸化狀態(tài)與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。BST2是一種Ⅱ型單程跨膜蛋白，具有獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，充當(dāng)細(xì)胞膜和出芽病毒粒子之間的橋梁，將出芽病毒粒子限制在細(xì)胞膜上，阻礙其感染其他正常細(xì)胞。另一方面，限制因子通過與病毒核酸相互作用限制病毒復(fù)制，APOBEC3酶催化病毒單鏈DNA的脫氨反應(yīng)，產(chǎn)生對病毒致死的G→A高突變現(xiàn)象，產(chǎn)生缺陷病毒蛋白和非傳染性病毒顆粒阻斷反轉(zhuǎn)錄[41-42]。CCCH型鋅指抗病毒蛋白(CCCH-zinc finger antiviral protein，CCCH-ZAP)作為宿主天然防御因子，可以通過識別并結(jié)合病毒蛋白發(fā)揮抗病毒作用，還可通過競爭結(jié)合的方式使ALV-J囊膜蛋白中ISU從類Norbin蛋白(NLP)上脫離，解除病毒造成的免疫抑制，恢復(fù)T細(xì)胞對外來病原體的免疫反應(yīng)能力[43]。通過研究不同宿主限制因子與病毒生命周期階段的相互作用，有助于了解ALV-J傳播復(fù)制的機(jī)制，并利用這些限制因子的抗病毒作用開發(fā)新的治療方法。

圖2 限制因子阻斷逆轉(zhuǎn)錄病毒生命周期的特定階段[21]

5 展望

除了ALV-J外，其他亞群的ALV如A、B、C、D、E和K亞群等均可通過水平傳播和垂直傳播感染雞只，進(jìn)而導(dǎo)致雞只發(fā)生腫瘤和免疫抑制。而ALV與其他反錄病毒的部分基因同源，產(chǎn)生腫瘤或免疫抑制的分子機(jī)制也部分相似，因此，可為解析宿主抗病毒的天然免疫機(jī)制互相提供參考。例如Mx蛋白是一類由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生具有抗病毒活性的動力蛋白樣GTP酶，可以抑制人體免疫缺損病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus，EIAV)、貓免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus，F(xiàn)IV)等反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制，但其對于ALV-J的抗病毒活性卻還未研究。研究顯示，ALV-J感染SPF雛雞后，在ALV-J感染的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)中Mx1表達(dá)顯著增加，而其是否發(fā)揮抗病毒作用還未可知。到目前為止，雖然人們對于ALV-J的感染、復(fù)制、致瘤、免疫抑制及其天然抗病毒免疫的分子致病機(jī)制進(jìn)行了研究，但是相對于人源反轉(zhuǎn)錄病毒分子機(jī)制研究的深入程度而言，還需要更深入的研究，從而為臨床上ALV-J新型藥物及疫苗的研制提供基礎(chǔ)。