李雅等

摘要：目的 探討益心泰顆粒對(duì)慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）兔心肌組織原癌基因C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)的影響。方法 采用阿霉素耳緣靜脈注射建立CHF兔模型，將成模家兔隨機(jī)分為模型組、氯沙坦鉀組和益心泰低、中、高劑量組，另設(shè)正常組。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組和正常組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周。觀察心功能指標(biāo)，檢測(cè)心肌組織C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、E峰與A峰的比值（E/A）顯著降低（P<0.01），C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組LVEF、LVFS、E/A顯著升高（P<0.01），C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 益心泰顆?？捎行б种菩募〗M織C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)，提高心功能。

關(guān)鍵詞：益心泰顆粒；慢性心力衰竭；原癌基因；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.017

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）08-0063-04

Effects of Yixintai Granules on Expression of C-Myc mRNA and Its Protein in Myocardial Tissues of Rabbits with Chronic Heart Failure LI Ya1， GUO Zhi-hua2， WU Gang-qiang2， TANG Yun2， MAO Xiang-ping3， WANG Yue-ai2， SUN Tao2 （1.Pharmacy College， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM， Changsha 410007， China； 3.The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM， Changsha 410005， China）

Abstract：Objective To explore the effects of Yixintai Granules on expression of C-Myc mRNA and its protein in myocardial tissues of rabbits with chronic heart failure （CHF）. Methods CHF rabbit models were established by ear marginal vein injection of adriamycin. Successfully modeled rabbits were divided into the model group， the Losartan Potassium group， the high-， medium-， and low dose Yixintai Granules groups. Besides， a normal control group was set up. Administration groups were given relevant medicine for gavage， equal volume of physiological saline was administered to rabbits of the model group and the normal control group by gastrogavage. The intervention lasted for 4 weeks， once per day. Echocardiographic indexes and mRNA and protein expression levels of C-Myc in myocardial tissue were detected after 4 weeks of medication. Results Compared with the normal group， the LVEF， LVFS， and E/A of the model group decreased significantly （P<0.01）， but mRNA and protein expression levels of C-Myc in myocardial tissues increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the LVEF， LVFS， and E/A of YG groups and Losartan Potassium group increased significantly （P<0.01）， but mRNA and protein expression levels of C-Myc in myocardial tissues decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Yixintai Granules can effectively inhibit the expression of mRNA and protein expression of C-Myc， and improve cardiac function.

Key words：Yixintai Granules；chronic heart failure；C-Myc；rabbits

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81373816）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2013B327）

通訊作者：郭志華，E-mail：guozhihua112@163.com

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是心血管疾病的終末期表現(xiàn)，隨著年齡的增長(zhǎng)，其發(fā)病率逐漸增加，目前已成為危害人類健康的主要疾病之一。近年來，有研究表明，原癌基因C-Myc等作為轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)，與CHF關(guān)系密切[1]。但C-Myc的功能作用在CHF的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。前期研究表明，益心泰可改善心衰大鼠的心肌重構(gòu)和心功能[2]。本研究采用益心泰顆粒干預(yù)阿霉素耳緣靜脈注射致CHF模型兔，探討其治療CHF的作用機(jī)制，為其臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

成年健康普通級(jí)新西蘭兔150只，雌雄各半，體質(zhì)量1.7～2.0 kg，長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2009-00121。室溫23 ℃飼養(yǎng)，濕度55%，通風(fēng)，分籠飼養(yǎng)，飼料及水均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物

益心泰顆粒由黃芪、丹參、紅花、澤瀉、豬苓等組成，每克益心泰顆粒含原藥材3.1 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供；氯沙坦鉀，杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)20140212；鹽酸阿霉素，深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號(hào)20140703。

1.3 主要試劑與儀器

C-Myc抗體（貨號(hào)BA1284-2），武漢博士德生物技術(shù)有限公司。TP-2200B電子天平，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；IE33彩色多普勒超聲診斷儀，荷蘭Philips公司；Nova Blot半干法轉(zhuǎn)印儀、SDS-PAGE垂直電泳儀及ImageQuant LAS 4000mini凝膠成像儀，美國(guó)GE Healthcare公司；PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；HT7700型投射電鏡，日本日立高新技術(shù)公司。

1.4 造模

參照文獻(xiàn)[3]方法。將鹽酸阿霉素配制成濃度為1 mg/mL 的溶液，經(jīng)耳緣靜脈注射，藥量為1 mg/kg，每周2次，連續(xù)8周。造模后左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、E峰與A峰的比值（E/A）顯著降低（P<0.01），室間隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPW）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）顯著升高（P<0.01），且家兔出現(xiàn)精神差、少動(dòng)、納食減少等CHF表現(xiàn)，說明造模成功。

1.5 分組與給藥

將成模兔隨機(jī)分為5組，模型組（21只）、氯沙坦鉀組（20只）和益心泰低、中、高劑量組（各21只），另設(shè)正常組（19只）。于實(shí)驗(yàn)第9周開始灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，益心泰低、中、高劑量組分別予益心泰顆粒2.1、4.2、8.4 g/kg灌胃，氯沙坦鉀組予氯沙坦鉀2.73 mg/kg灌胃。連續(xù)4周，1次/d，灌胃體積為10 mL/kg。用藥4周內(nèi)，模型組、氯沙坦鉀組及益心泰低、中、高劑量組因腹瀉致死2、1、1、1、1只，而正常組兔全部存活。

1.6 取材

用藥4周后，行心臟彩超，檢測(cè)心功能指標(biāo)后，處死全部實(shí)驗(yàn)兔，取兔心肌組織，切成多份，100 mg/份，待測(cè)。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 心功能指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用彩色多普勒超聲診斷儀檢測(cè)LVEF、LVFS、E/A。

1.7.2 心肌組織原癌基因蛋白表達(dá) 心肌組織冰上勻漿60 min，充分裂解后，4 ℃、21 000×g離心30 min，取上清液，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)，制備SDS-PAGE濃縮膠與分離膠、上樣，電泳，先16 mA/gel電泳15 min，然后32 mA/gel至溴芬蘭指示劑到達(dá)膠的底部時(shí)即停止，然后0.8 mA/cm2轉(zhuǎn)移1、2、3 h，封閉、配一抗、上一抗、上二抗及Actin，顯影成像，計(jì)算其與β- actin的比值。

1.7.3 心肌組織原癌基因mRNA表達(dá) 提取總RNA：Trizol抽提總RNA，測(cè)定OD值，檢測(cè)RNA純度及濃度并定量。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：42 ℃、60 min，75 ℃、10 min，4 ℃、5 min。引物設(shè)計(jì)與合成：β-actin上游5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3'，下游5'-AGGGGC CGGACGCGTCATACT-3'；C-Myc上游5'-AGAGTTTCATCTG CGACCCG-3'，下游5'-GCTGCGTAGTTGTGCTGATGTG-3'。PCR反應(yīng)體系：95 ℃、5 min，94 ℃、1 min，54 ℃、1 min， 72 ℃、1 min，重復(fù)30次，然后72 ℃、5 min，4 ℃冰箱保存。凝膠電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，電壓120 V，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用Gel pro 4.0凝膠成像系統(tǒng)分析，計(jì)算C-Myc/β-actin比值。

1.7.4 心肌組織病理結(jié)構(gòu) 醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示。兩組間均數(shù)比較，采用成組t檢驗(yàn)；多樣本間均數(shù)比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益心泰顆粒對(duì)兔心功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組LVEF、LVFS、E/A顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，益心泰低、中、高劑量組及氯沙坦鉀組LVEF、LVFS、E/A顯著升高（P<0.01）。結(jié)果見表1。

2.2 益心泰顆粒對(duì)兔心肌組織原癌基因蛋白及mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組心肌組織C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組心肌組織C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2、圖1、圖2。

注：1.正常組；2.模型組；3.益心泰低劑量組；4.益心泰中劑量組；

5.益心泰高劑量組；6.氯沙坦鉀組（下同）

2.3 益心泰顆粒對(duì)兔心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

正常組肌纖維密度均勻一致，收縮帶正常，線粒體正常，間質(zhì)無變化；模型組肌絲壞死、溶解，只殘留肌纖維輪廓；益心泰低劑量組肌絲稀疏、溶解、壞死，線粒體固縮，嵴消失；益心泰中劑量組肌絲局灶性溶解、壞死，線粒體部分空泡化；益心泰高劑量組肌原纖維清晰，肌小節(jié)明顯，部分線粒體變細(xì)，空泡化；氯沙坦鉀組肌絲局灶性溶解，線粒體結(jié)構(gòu)尚可。結(jié)果見圖2。

3 討論

本研究采用阿霉素耳緣靜脈注射致CHF模型，但阿霉素可導(dǎo)致結(jié)腸炎，而降低造模成功率[4]。本研究造模過程中，家兔因腹瀉致死率高達(dá)20%，推測(cè)其原因，可能是家兔不耐受阿霉素的毒副作用，出現(xiàn)腸炎，最后因脫水而發(fā)生休克致死。Myc在成年小鼠心肌細(xì)胞表達(dá)，導(dǎo)致小鼠發(fā)生嚴(yán)重的肥厚性心肌病，最終可發(fā)展為充血性心力衰竭而死亡，并發(fā)現(xiàn)這些小鼠心肌細(xì)胞周期標(biāo)記和DNA復(fù)制指標(biāo)顯著增加，電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ缺陷，由此推測(cè)其機(jī)制可能與細(xì)胞周期事件和線粒體功能失調(diào)有關(guān)[5]。C-Myc在心臟疾病中的異常改變比其他都早，故抑制C-Myc表達(dá)將成為一種非常有效地預(yù)防和治療心肌病和CHF的范式[6]。

CHF按照其證候?qū)W特征，可歸屬中醫(yī)“心悸”“水腫”“心痹”等范圍。其總病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以氣虛、陽(yáng)虛為主，標(biāo)實(shí)以瘀血、水飲居多。基于此理論，組方益心泰顆粒。方中黃芪既可補(bǔ)氣以促進(jìn)血液運(yùn)行，又能利水消腫，為君藥；丹參、紅花為活血化瘀要藥，均為臣藥，黃芪、丹參紅花合用，共奏益氣活血化瘀之功；澤瀉味甘、淡、寒，歸腎和膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱之功效；豬苓功專利水滲濕；澤瀉、豬苓合用以加強(qiáng)利水消腫，共為佐藥。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組心肌組織C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），LVEF、LVFS、E/A顯著降低（P<0.01），且電鏡結(jié)果顯示，心肌肌絲壞死、溶解，說明CHF兔心肌組織C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)升高，心肌肌絲發(fā)生壞死、溶解，心功能下降。用藥4周后，益心泰低、中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01），LVEF、LVFS、E/A顯著升高（P<0.01），且電鏡結(jié)果顯示，心肌肌絲壞死、溶解的范圍縮小，說明益心泰顆?？梢种菩募〗M織C-Myc蛋白及mRNA的表達(dá)，改善心肌超微結(jié)構(gòu)，提高心功能。

綜上可知，益心泰顆粒可有效抑制心肌組織C-Myc蛋白及mRNA表達(dá)，提高心功能，這可能是益心泰有效干預(yù)CHF的機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen HB， Wang L， Jiang JF. Re-analysis of expression profiles for revealing new potential candidate genes of heart failure[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（7）：903-911.

[2] 吳華堂，吳剛強(qiáng)，申思，等.益心泰對(duì)漫性心力衰竭大鼠心肌重構(gòu)和心功能的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（7）：23-26.

[3] 張靜，李庚山，李國(guó)草，等.兔阿霉素心衰模型的建立[J].心臟雜志， 2004，16（5）：437-439.

[4] Kinugawa T， Kato M， Yamamoto K， et al. Proinflammatory cytokine activation is linked to apoptotic mediator， soluble Fas level in patients with chronic heart failure[J]. Int Heart J，2012，53（3）：182-186.

[5] Lee HG， Chen Q， Wolfram JA， et al. Cell cycle re-entry and mitochondrial defects in myc-mediated hypertrophic cardiomyopathy and heart failure[J]. PLoS One，2009，4（9）：7172.

[6] Wolfram JA， Lesnefsky EJ， Hoit BD， et al. Therapeutic potential of c-Myc inhibition in the treatment of hypertrophic cardiomyopathy[J]. Ther Adv Chronic Dis，2011，2（2）：133-144.

（收稿日期：2014-11-21）

（修回日期：2014-12-18；編輯：華強(qiáng)）