張東輝，白玉彬，董 朕，陳 晨，申涵露，李 冰，周緒正

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所 農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

羥氯扎胺(oxyclozanide,OXY)又名五氯柳胺，是水楊酰苯胺類抗寄生蟲藥物。作為氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，其主要作用機理是通過抑制寄生蟲蟲體內(nèi)的氧化磷酸化過程，來阻止蟲體線粒體中的三磷酸腺苷(ATP)生成，進而導(dǎo)致蟲體因能量代謝紊亂而死亡[1]。OXY具有廣譜、低毒、低殘留等優(yōu)良特性[2-4]，主要用于治療牛羊吸蟲病，尤其對肝片吸蟲治療效果更為突出，同時對絳蟲、線蟲也有良好的治療效果[5-7]。阿苯達(dá)唑(albendazole,ABZ)又名丙硫咪唑，是苯并咪唑類驅(qū)蟲藥,能選擇性與不可逆性抑制蟲體攝取葡萄糖，使蟲體內(nèi)源性糖原耗竭，并抑制延胡索酸酶系統(tǒng)，阻礙ATP的產(chǎn)生，致使蟲體死亡,是一種廣譜、高效、低毒的驅(qū)蟲藥[8]。

由于牧區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境的復(fù)雜性，牛、羊等經(jīng)濟型動物在養(yǎng)殖過程中往往會出現(xiàn)多種寄生蟲混合感染[9-10]，在治療過程中因可選用的復(fù)方制劑缺乏，只能選用多種單一驅(qū)蟲藥聯(lián)合給藥，或者選用廣譜驅(qū)蟲藥進行治療。目前國外的復(fù)方制劑有羥氯扎胺鹽酸左旋咪唑混懸液，而國內(nèi)復(fù)方制劑只有阿苯達(dá)唑伊維菌素預(yù)混劑，因此研發(fā)一種新的抗寄生蟲復(fù)方制劑事不宜遲。本團隊研發(fā)的羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方制劑可以起到增加抗蟲譜，減少給藥劑量等作用，避免單一驅(qū)蟲藥頻繁使用而產(chǎn)生耐藥性問題，有效的促進畜牧業(yè)健康發(fā)展。李曉婷等[11]采用HPLC只對OXY原料藥中的2個雜質(zhì)進行檢測，為了更嚴(yán)格地控制復(fù)方混懸液的質(zhì)量，本試驗將采用高效液相色譜法建立了羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液的含量及有關(guān)物質(zhì)測定方法，對OXY、ABZ在2015版《英國藥典》中規(guī)定的所有雜質(zhì)進行測定[12-14]。OXY、ABZ及各相關(guān)雜質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 ABZ及相關(guān)雜質(zhì)A～F和OXY及相關(guān)雜質(zhì)G、H的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 主要儀器Agilent-LC 1290高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；ME403型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ΜPT-Ⅱ-40L優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(上海優(yōu)普實業(yè)有限公司)。

1.2 主要試劑OXY標(biāo)準(zhǔn)品(含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.7%，批號：RSB-160703,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；ABZ標(biāo)準(zhǔn)品(含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.9%，批號：100373-201103，中國食品藥品檢定研究院)；3,5,6-三氯水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品(含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.0%，批號：151708，阿拉丁試劑有限公司)；2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽(含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%，批號：A2246，英國藥典委員會)；ABZ雜質(zhì)A、B、C、D、E、F對照品(含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.0%,98.0%,98.0%,98.0%,98.0%和97.0%，Trc公司)；羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液(含量：4.0%，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制)。

甲醇、冰乙酸(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(色譜純，Merck)；甲酸、甲酸銨(色譜純，F(xiàn)lsher)；超純水(優(yōu)普)。

1.3 色譜條件色譜柱：Agilent Poroshell EC-C18(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱溫：35℃；進樣量：3 μL；流速：0.8 mL/min；流動相：A相為0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨水溶液，B相為甲醇；檢測波長：292，320 nm；梯度洗脫如表1。

表1 HPLC梯度洗脫條件 %

1.4 溶液制備

1.4.1供試品溶液 取羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液適量(約相當(dāng)于OXY和ABZ各80 mg)，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入適量冰乙酸、甲醇分別超聲10 min，最后再用甲醇定容至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

1.4.2對照品溶液 精密移取1.4.1供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用流動相定容至刻度，充分搖勻，即為對照品溶液。

1.4.3空白輔料 按處方比例稱取羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液輔料適量(約相當(dāng)于OXY和ABZ各80 mg)，置于100 mL量瓶中，用流動相稀釋并定容至刻度，搖勻。

1.4.4對照品儲備液 分別精密稱取OXY、ABZ標(biāo)準(zhǔn)品約20 mg及雜質(zhì)A、B、C、D、E、F對照品各約4 mg，3,5,6-三氯水楊酸約60 mg和2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽約6 mg置于20 mL量瓶中，用適量DMSO超聲溶解，再用甲醇定容至刻度，作為對照品儲備液Ⅰ。精密移取對照品儲備液Ⅰ1.0 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液Ⅱ。

1.4.5系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取OXY和ABZ標(biāo)準(zhǔn)品約1 mg，置于50 mL量瓶中，用冰乙酸酸化的甲醇溶解。精密量取對照品儲備液Ⅱ適量，用甲醇定容至刻度，搖勻，最終配制成主成分與雜質(zhì)比例為200∶10的專屬性溶液，即為系統(tǒng)適用性溶液。

1.5 專屬性試驗分別取1.4.1供試品溶液、1.4.3空白輔料溶液和1.4.5系統(tǒng)適用性溶液，按1.3色譜條件進樣，記錄色譜圖。

1.6 破壞試驗取羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液適量(約相當(dāng)于OXY、ABZ各80 mg)5份，置于100 mL量瓶中，加入適量冰乙酸、甲醇各超聲10 min，分別經(jīng)酸、堿、氧化、光照、高溫破壞后，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為破壞溶液。破壞試驗操作如下：

強酸破壞：加入1 mol/L鹽酸溶液4.0 mL,室溫條件下放置2 d后，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL中和；強堿破壞：加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL,室溫條件下放置2 d后，加入1 mol/L鹽酸溶液4.0 mL中和；氧化破壞：加入體積分?jǐn)?shù)為3%雙氧水4.0 mL室溫條件下避光放置30 min；光照破壞：置于光照箱內(nèi)(4 500±500) lx照射2 d；高溫破壞：置于藥物穩(wěn)定儀中，高溫60℃，放置2 d。

分別吸取上述破壞試驗樣品溶液3 μL，按1.3色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。

1.7 精密度進樣精密度：精密量取1.4.5系統(tǒng)適用性溶液3 μL，按1.3色譜條件進樣分析，連續(xù)分析6次，計算各個雜質(zhì)與主成分的保留時間和峰面積的RSD。

中間精密度：精密量取1.4.1供試品溶液6份，由甲、乙2人分別在不同時間段，使用2臺不同儀器，按1.3色譜條件進樣分析，計算各個雜質(zhì)與主成分的保留時間和含量的RSD。

1.8 定量限與檢測限取1.4.4各雜質(zhì)對照品及ABZ、OXY主成分對照品儲備液Ⅰ逐級稀釋，按1.3色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以信噪比S/N為3時對應(yīng)的濃度為檢測限(LOD)；以信噪比S/N為10時對應(yīng)的濃度為定量限(LOQ)。

1.9 線性范圍考察分別精密移取1.4.4下ABZ、OXY以及各雜質(zhì)對照品儲備液Ⅱ0.10,0.25,0.40,0.50,0.60 mL于5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得到不同濃度的線性標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取3 μL，按1.3色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(ρ，mg/L)為橫坐標(biāo)，按最小二乘法進行線性回歸。

1.10 重復(fù)性試驗按1.4.1方法平行制備6份供試品溶液，按1.3色譜條件進樣分析。

1.11 溶液穩(wěn)定性按1.4.1和1.4.2方法制備供試品溶液和對照品溶液，在室溫條件下放置，分別于0,2,4,6,8,12 h取樣，按1.3色譜條件的進樣分析，計算各雜質(zhì)保留時間和峰面積的RSD值。

1.12 回收率試驗分別精密稱取OXY、ABZ對照品8 mg，置于10 mL量瓶中，共9份，按處方量稱取空白輔料，加入適量冰乙酸、甲醇分別超聲10 min，精密量取1.4.4雜質(zhì)對照品儲備液Ⅱ0.8,1.0,1.2 mL,并用甲醇定容至刻度，搖勻，作為低、中、高(80%,100%,120%)3個濃度水平的供試品溶液，每個水平平行制備3份。按1.3色譜條件進樣分析，計算各回收率樣品中雜質(zhì)的含量(按外標(biāo)法扣除本底值之后計算)。

1.13 耐用性試驗取系統(tǒng)適用性溶液，在1.3色譜條件下，通過改變流速(±10%)、柱溫(±5℃)、流動性比例(±2%)，換用不同類型的不同廠家色譜柱，觀察各組分之間的分離情況以及有關(guān)物質(zhì)含量的變化。

1.14 有關(guān)物質(zhì)含量測定取羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液3批樣品(批號：20201007、20201008、20201009)，按1.4方法制備供試品溶液和自身對照品溶液，按1.3色譜條件進樣分析。采用不加校正因子的主成分自身對照法計算雜質(zhì)含量，記錄供試品溶液和自身對照品溶液色譜圖至主成分保留時間的2倍，其中供試品溶液中任何小于自身對照品溶液主峰面積的0.05倍的峰可忽略不計。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗由圖2可知，各雜質(zhì)與主成分OXY和ABZ之間以及各雜質(zhì)之間的峰分離度均大于1.5，且峰形良好，出峰順序依次為雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)F、雜質(zhì)A、2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽、3,5,6-三氯水楊酸、ABZ和OXY，同時空白輔料不干擾測定，表明本方法專屬性好。

2.2 破壞性試驗由圖3可知，羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液在強酸、強堿、光照、氧化的破壞條件下均有降解，主要降解產(chǎn)物是雜質(zhì)B(阿苯達(dá)唑亞砜)；在高溫破壞后主要降解產(chǎn)物是雜質(zhì)B(阿苯達(dá)唑亞砜)和雜質(zhì)A(5-丙基硫烷基-1H-苯并咪唑-2-胺)；在強光和氧化破壞中，主要是ABZ發(fā)生降解，其降解產(chǎn)物為雜質(zhì)B。在各種破壞條件下，羥氯扎胺阿苯達(dá)唑主峰與各雜質(zhì)峰均能良好分離，物料守恒均在90.0%～100.0%，分離度大于1.5，表明在本色譜條件下可以有效分離和檢測各強制破壞降解產(chǎn)物，同時為各有關(guān)物質(zhì)的來源做充分判斷依據(jù)。

圖3 高溫(A)、酸(B)、堿(C)、氧化(D)和光照(E)破壞的色譜圖

2.3 精密度

2.3.1進樣精密度 連續(xù)進樣6次，其各個雜質(zhì)與主成分的保留時間和峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好，儀器較穩(wěn)定。

2.3.2中間精密度 分別由甲、乙2個人在不同時間，使用不同儀器連續(xù)進樣分析6次，其各個雜質(zhì)與主成分的保留時間和峰面積的RSD均小于2.0%，表明中間精密度良好。

1.雜質(zhì)D；2.雜質(zhì)E；3.雜質(zhì)B；4.雜質(zhì)C；5.雜質(zhì)F；6.雜質(zhì)A；7.2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽；8.3,5,6-三氯水楊酸；9.ABZ；10.OXY；11.未知雜質(zhì)1；12.未知雜質(zhì)2；13.未知雜質(zhì)3圖2 空白輔料(A)、系統(tǒng)適用性溶液(B)和羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液(C)的色譜圖

2.4 定量限與檢測限試驗結(jié)果表明，當(dāng)S/N為10時，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、3,5,6-三氯水楊酸、2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽、OXY、ABZ的定量限分別為0.10,0.06,0.07,0.10,0.15,0.13,5.00,0.30,0.10,0.30 mg/L；當(dāng)S/N為3時，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F、3,5,6-三氯水楊酸、2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽、OXY、ABZ的檢測限限分別為0.030,0.020,0.022,0.030,0.050,0.032,2.000,0.100,0.025,0.012 mg/L。

2.5 線性范圍考察以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(ρ，mg/L)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得到各個雜質(zhì)與主成分的線性回歸方程，其R2均大于0.999，表明線性關(guān)系良好。各個雜質(zhì)與主成分的線性回歸方程見表2。

表2 OXY、ABZ及各個雜質(zhì)的線性、定量限和檢測限結(jié)果 mg/L

2.6 重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，主成分OXY、ABZ以及各個雜質(zhì)的保留時間和峰面積的RSD值均小于2.0%，表明該方法重現(xiàn)性良好，試驗結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果 %

2.7 溶液穩(wěn)定性在不同時間段對供試品溶液和對照品溶液取樣分析，各個雜質(zhì)保留時間與峰面積的RSD值均小于2.0%，且無新雜質(zhì)產(chǎn)生，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定，試驗結(jié)果見表4。

表4 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果 %

2.8 回收率試驗由表5可知，各個雜質(zhì)及其主成分在低、中、高3個濃度下的回收率均在97.0%～107.0%。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9) %

2.9 耐用性試驗結(jié)果表明，在各個條件下，主峰與各雜質(zhì)峰均能分離，且各雜質(zhì)含量的RSD均小于2.0%，結(jié)果說明在流動相比例、柱溫、流速及色譜柱的微小變化對有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果無顯著性影響，表明該方法耐用性良好。

3.1 有關(guān)物質(zhì)含量測定采用上述色譜方法對3批樣品有關(guān)物質(zhì)進行測定，由表6可知，樣品中含有3個未知雜質(zhì)，雜質(zhì)B含量略高但均小于0.5%；所有單雜質(zhì)含量均小于0.5%，總雜質(zhì)含量均小于1.0%。

表6 樣品有關(guān)物質(zhì)的測定結(jié)果(n=3) %

3 討論

3.1 檢測波長分別取1.4各對照品溶液，用紫外分光光度計進行全波長掃描，雜質(zhì)3,5,6-三氯水楊酸最大紫外吸收在320 nm處，其余各雜質(zhì)在292 nm處均有最大吸收，這與英國藥典中ABZ混懸液采用292 nm波長檢測有關(guān)物質(zhì)含量，所采用的波長相一致。同時由于復(fù)方制劑各成分之間比較復(fù)雜，雜質(zhì)也相對較多，采用單波長很難充分檢出[15-16]，因此，采用292和320 nm雙波長對羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液有關(guān)物質(zhì)進行檢測，靈敏度更高，準(zhǔn)確性更好，能夠準(zhǔn)確定量檢測。

3.2 色譜條件的確定根據(jù)相關(guān)文獻[17-19]，并參考各化合物的PKa值，本試驗首先對甲醇-水、甲醇-磷酸鹽和乙腈-磷酸鹽3種梯度洗脫系統(tǒng)進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時，2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽與主成分ABZ分離效果較差，且ABZ和OXY主峰峰形分別出現(xiàn)前傾和拖尾現(xiàn)象。采用甲醇-磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時，在OXY主峰后出現(xiàn)未知峰，影響分離度，分別采用鈉鹽、鉀鹽、銨鹽均無法消除。所以本試驗確定以甲醇-甲酸銨緩沖體系作為流動相。其次為改善色譜峰峰形并提高分離度，對流動相添加劑如磷酸、三氟乙酸、甲酸等進行考察，結(jié)果顯示0.1%甲酸峰形較好，且各雜質(zhì)與主峰之間的分離效果最佳，故最終流動相選擇甲醇-0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨緩沖系統(tǒng)。

3.3 有關(guān)物質(zhì)來源分析通常復(fù)方制劑在生產(chǎn)的過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)情況比較復(fù)雜，且據(jù)2013版《英國藥典》《歐洲藥典》8.0版收藏的ABZ原料藥中有A、B、C、D、E、F 6個雜質(zhì)，OXY原料藥有2個雜質(zhì)。對強酸、強堿、高溫、氧化、光照等破壞試驗產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進行分析，ABZ、OXY在復(fù)方制劑中較為穩(wěn)定，對酸、堿均不敏感，其有關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生主要與ABZ氧化破壞有關(guān)，這與黃毅等[14]結(jié)果相一致，說明其主要雜質(zhì)來源是藥物的氧化產(chǎn)物，可能ABZ分子中含有丙硫基，易被氧化為雜質(zhì)B(阿苯達(dá)唑亞砜)，阿苯達(dá)唑亞砜是主要的降解產(chǎn)物，且阿苯達(dá)唑亞砜作為ABZ的活性物質(zhì)，是體內(nèi)發(fā)揮殺蟲作用的主要成分，其本身不具有毒性，因此雜質(zhì)B能間接反映樣品的生產(chǎn)工藝、處方以及貯存條件變化情況，對羥氯扎胺阿苯達(dá)唑復(fù)方混懸液質(zhì)量控制有著重要意義。在高溫破壞性試驗中表明未知雜質(zhì)1主要是由高溫產(chǎn)生，且在ABZ原料藥中也檢測到未知雜質(zhì)1，因此在儲藏過程中要陰涼處保存；白玉彬等[20]研究表明OXY混懸液有2個未知雜質(zhì)，是OXY原料藥在合成過程中產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)，用1.3色譜條件對OXY混懸液供試品進樣分析，發(fā)現(xiàn)未知雜質(zhì)2和3與OXY混懸液中的2個未知雜質(zhì)保留時間一致，故該雜質(zhì)可能來源于OXY原料藥中。因此需要將已知雜質(zhì)B和未知雜質(zhì)1，2，3進行重點控制。

3.4 雜質(zhì)限度的確定經(jīng)檢測3批樣品中雜質(zhì)B的含量分別為0.436%，0.444%，0.391%，未知雜質(zhì)的總量為0.194%，0.199%，0.200%。在2013版《英國藥典》對于ABZ采用HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)，規(guī)定單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照品溶液主峰面積的1.0%，各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對照品主峰面積的2倍(2.0%)，而2015版《中國藥典》對于ABZ有關(guān)物質(zhì)測定依舊采用薄層色譜法；本團隊在前期建立的HPLC檢測OXY有關(guān)物質(zhì)的方法，規(guī)定單個雜質(zhì)含量小于0.5%，總雜質(zhì)含量小于1.0%。參考2012版《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》中“獸用化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則”當(dāng)雜質(zhì)有特殊的藥理活性時，則雜質(zhì)的限度可以適當(dāng)放寬，其制劑的雜質(zhì)質(zhì)控限度為1.0%[21]。趙亞萍等[22]制定了ABZ原料藥中有關(guān)物質(zhì)檢查限度為單雜不超過1.0%，總雜不超過2.0%。劉曉敏等[23]制定了丁二磺酸腺苷蛋氨酸腸溶片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中規(guī)定雜質(zhì)甲硫腺苷的含量不得大于2.0%，其他已知雜質(zhì)不得大于0.5%，單個未知雜質(zhì)含量不得大于0.2%，未知雜質(zhì)總含量不得大于1.0%。因此最終確定本混懸液雜質(zhì)B(阿苯達(dá)唑亞砜)含量不得超過1.0%，其他已知雜質(zhì)含量不得大于0.5%，且已知雜質(zhì)總和不得大于2.0%；單個未知雜質(zhì)含量不得大于0.5%，未知雜質(zhì)總和不得大于1.0%。