牛偉杰，于學(xué)祥，高 宇，庫旭鋼，何啟蓋,3*，羅 銳*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物疫病診斷中心，湖北 武漢 430070)

非洲豬瘟(ASF)是一種烈性傳染病，可引起感染豬較高的死亡率，對世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而自2018年ASF傳入我國以來，目前流行形式依然嚴(yán)峻。非洲豬瘟病毒(ASFV)感染可引起患病豬體表及內(nèi)臟廣泛的出血和水腫，并可導(dǎo)致100%的死亡率[1]。經(jīng)典豬瘟(CSF)、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)同樣是目前嚴(yán)重?fù)p害我國及世界生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的常見傳染性病毒病。CSF在豬群中擴(kuò)散后發(fā)病率高達(dá) 80%～100%，皮膚出血、高燒，厭食，胃腸道癥狀，全身無力和結(jié)膜炎等均是CSF感染的表現(xiàn)。PRRS可導(dǎo)致發(fā)病豬的耳朵及其他部位皮膚發(fā)紺，因此得名“豬藍(lán)耳病”[2]。我國《國家中長期動物疫病控制規(guī)劃(2012—2020年)》要求到2020年優(yōu)先對種豬場實(shí)行CSF、PRRS的凈化，并逐步推行至對全國范圍的豬場。

在不同規(guī)?；B(yǎng)豬場中，ASF、CSF、PRRS等疾病不僅嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益，且感染豬臨床癥狀的高度相似性，使得養(yǎng)殖技術(shù)人員難以通過病豬表現(xiàn)進(jìn)行鑒別[2-3]。而多重檢測方法，高效的鑒別診斷則提供了有力支持，同時(shí)簡化操作步驟、降低實(shí)驗(yàn)污染風(fēng)險(xiǎn)、節(jié)約樣品、試劑成本以及試驗(yàn)時(shí)間，可為臨床疾病檢測提供更高效的服務(wù)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞、病毒和疫苗毒株 豬瘟病毒疫苗毒株(HCLV)及疫苗稀釋液購于武漢科前生物股份有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(JXA1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬日本乙型腦炎病毒(JEV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)以及Marc-145細(xì)胞(非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli5α感受態(tài)細(xì)胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 病毒(DNA/RNA)核酸提取試劑盒以及全自動核酸提取儀購自(西安)天隆科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BIOWEST瓊脂糖、2×Es Taq MasterMix、DL2000 DNA Marker、DMSO、和2×Probe MasterMix購自大連寶生物技術(shù)有限公司(TaKaRa)；GoldenView核酸染料購自北京艾德萊生物科技有限公司；DEPC水以及50×TAE電泳緩沖液購于生工生物工程(上海)股份有限公司；TSA培養(yǎng)基購自美國BD公司。

1.1.3樣品來源 本研究共收集了839份全血(EDTA抗凝血)樣品，為2019年2月至2020年1月來自湖北省、湖南省和江西省，為保育和育肥階段有皮膚發(fā)紺、體溫升高等癥狀豬只的14家規(guī)模化豬場。

1.2 方法

1.2.1引物和探針的設(shè)計(jì) 本研究在設(shè)計(jì)引物及探針時(shí)參考CSFV、PRRSV流行的所有亞型，使用Primer5.0軟件分別對CSFV 保守區(qū)域5′UTR基因、PRRSV保守區(qū)域ORF6基因設(shè)計(jì)多對引物和探針以供篩選。ASFV引物及探針序列參考OIE《陸生動物診斷實(shí)驗(yàn)及疫苗手冊2019》推薦序列。ASFV(F:5′-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3′,R:5′-GATACCACAAGATCAGGCCGT-3′,Pro-be:5′-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGTAMRA-3′);CSFV(F:5′-AACGGAGGGACTAGCCATAG-3′,R:5′-GTGCTCAC-GTCG-AACTACTGA-3′,Probe:5′-ROX-CCTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTA-BHQ2-3′);PRRSV:(5′-ATCACCTCCAGATGCCGTTT-3′,R:5′-CG-ACAAATGCGTGGTTATCA-3′,Probe:5′-CY5-TACATTCTGGCCCCTGCCCACCAC-BHQ3-3′)。引物和探針均由武漢擎科生物有限公司合成，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2陽性質(zhì)粒的制備 使用本研究所設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒引物，以CSFV、PRRSV的cDNA為模版，按照以下反應(yīng)體系(表4)和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增(ASFV B646L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒前期由本實(shí)驗(yàn)室送生物公司合成)。CSFV-5′UTR(F：5′-GTATACGAGGTTAGCTCATTCTCG-3′,R:5′-GTGCCATGTAC-AGCAGAGATTTTTTA-3′)；PRRSV-ORF6(F:5′-CTTTTGGCGTTTTCCATTACC-3′,R:5′-CA-ACACGAGGCTTTTCAACC-3′)。擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 終延伸10 min，產(chǎn)物4℃短暫保存。

將產(chǎn)物膠回收純化，鏈接 pMD18-T 載體后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α。經(jīng)培養(yǎng)后挑取陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定并測序，將陽性質(zhì)粒測定濃度并計(jì)算拷貝數(shù)，進(jìn)行倍比稀釋后-20℃保存。

1.2.3多重qPCR反應(yīng)條件優(yōu)化 在多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)的條件下，使用DEPC H2O將引物及探針濃度分別稀釋為4，6，8，10，12，14，16，18 μmol/L，在體系中加入1 μL的引物以及探針，使其終濃度分別為0.16，0.24，0.32，0.40，0.48，0.56，0.64 μmol/L，摸索最佳濃度；退火溫度采用 58,59,60,61，62℃，循環(huán)數(shù)采用40次；反應(yīng)總體系采用25 μL。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 分別選取標(biāo)準(zhǔn)模板濃度梯度分別為103～107copies/μL的ASFV、CSFV、PRRSV標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，以去離子水為陰性對照模板，進(jìn)行多重qPCR體系擴(kuò)增。分別將結(jié)果分析繪制擴(kuò)增曲線，使用Microsoft Office Excel 2013軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5特異性試驗(yàn) 用建立的多重qPCR方法分別檢測PEDV、TGEV、PCV2、PRV、PPV和JEV，驗(yàn)證所建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性。

1.2.6敏感性試驗(yàn) 選取濃度梯度為 100～108copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，使用DEPC H2O做10倍倍比稀釋后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，作為陽性模板，以去離子水為陰性對照模板，進(jìn)行擴(kuò)增，探究其檢測下限。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 選取標(biāo)準(zhǔn)模板濃度梯度為 104～106copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)模板為陽性模板，以雙蒸水為陰性對照模板，進(jìn)行同一批次和不同批次的多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增，計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.2.8方法對比 本研究收集了自2019年12月至2020年1月來自湖北省6個(gè)規(guī)?；i場的180份樣品(組織樣2份、口腔液34份、全血144份)，分別使用OIE推薦的ASFV qPCR檢測方法和CSFV RT-qPCR、PRRSV-qPCR國標(biāo)檢測方法與本研究建立的多重RT-qPCR進(jìn)行比較。

1.3 ASFV、CSFV和PRRSV的病原學(xué)調(diào)查應(yīng)用所建立的多重qPCR方法檢測 2019年12月至2020年1月份送檢的 839 份保育和育肥階段豬只的抗凝血樣品，調(diào)查ASFV、CSFV、PRRSV 3種病原的流行情況和特點(diǎn),并使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的制備將過夜培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒作為模版，使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒引物進(jìn)行常規(guī) PCR 檢測，結(jié)果均為預(yù)期大小目的片段，PRRSV-ORF6：414 bp，CSFV-5′UTR：373 bp(圖1)，其中ASFV-B602L質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存(1.39×1010copies/μL)。經(jīng)測序均與目的基因相符。所構(gòu)建的CSFV質(zhì)粒的濃度為1.65×1010copies/μL，PRRSV質(zhì)粒的濃度為2.62×1010copies/μL。

左.PRRSV-ORF6；右.CSFV-5′UTR。M.DL2000 DNA Marker;1.PCR 產(chǎn)物；2.陰性對照圖1 質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化通過對引物和探針濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，選擇熒光強(qiáng)度高，Ct值較小、擴(kuò)增效率接近100%，非特異性信號未出現(xiàn)時(shí)最大循環(huán)數(shù)的條件。在調(diào)整其他影響因素的過程中，不同退火溫度差異較小，最終選擇為60℃。ASFV、CSFV、PRRSV引物的最佳濃度均為0.48 μmol/L，探針濃度均為0.40 μmol/L，結(jié)果見圖2～4。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立以優(yōu)化的反應(yīng)條件(體系25 μL:Mix 12.5 μL、引物和探針各1 μL(濃度分別為0.48和0.40 μmol/L)、質(zhì)粒1 μL、H2O 5.5 μL，溫度：60℃)。標(biāo)準(zhǔn)模板的擴(kuò)增曲線及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5～7。在 101～108copies/μL 的梯度濃度區(qū)間內(nèi)，顯示良好的線性關(guān)系，所得拷貝數(shù)(x)與Ct 值(y)的線性方程以及相關(guān)系數(shù)R2為：

ASFV:y=-3.558x+38.88，R2=0.998；

CSFV:y=-3.155x+39.55，R2=0.992；

PRRSV:y=-3.143x+38.23，R2=0.999。

左.ASFV引物;右.ASFV探針圖2 ASFV引物/探針濃度優(yōu)化

左.CSFV引物;右.CSFV探針圖3 CSFV引物濃度優(yōu)化

左.PRRSV引物;右.PRRSV探針圖4 PRRSV引物濃度優(yōu)化

左.擴(kuò)增曲線；右.標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5 ASFV擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

左.擴(kuò)增曲線；右.標(biāo)準(zhǔn)曲線圖6 CSFV擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

左.擴(kuò)增曲線；右.標(biāo)準(zhǔn)曲線圖7 PRRSV擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性試驗(yàn)分別以 PEDV、JEV、TGEV、PRRSV、CSFV、PPV、PCV2 和 PRV 的核酸為反應(yīng)模板，用所建方法擴(kuò)增，結(jié)果表明只有陽性模板有熒光信號(圖8)，說明所建方法特異性良好。

1.ASFV；2.CSFV；3.PRRSV；4～11.分別為PCV2、PCV3、PRV、JEV、FMDV、PED、TGE、PDCoV；12.陰性對照圖8 特異性試驗(yàn)

2.5 敏感性試驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)模板濃度梯度為100～108copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增擴(kuò)增，結(jié)果顯示，多重qPCR方法檢測ASFV、CSFV、PRRSV的拷貝數(shù)最低分別為 13，16,26個(gè)拷貝,說明所建方法靈敏性高(圖9～11)。

圖9 ASFV靈敏性實(shí)驗(yàn)

圖10 CSFV靈敏性試驗(yàn)

圖11 PRRSV靈敏性試驗(yàn)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)選取104～106copies/μL 的標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行組內(nèi)、組間重復(fù)試驗(yàn),結(jié)果見表8。結(jié)果表明變異系數(shù)均在2%以下，說明所建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在重復(fù)性方面表現(xiàn)優(yōu)秀。

表8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 方法對比OIE ASFV qPCR與所建方法均未檢出ASFV陽性核酸。

國標(biāo)CSFV RT-qPCR檢出核酸陽性37份，陰性143份；所建方法檢出CSFV陽性核酸35份，陰性145份。其中35份陽性樣品、143份陰性樣品結(jié)果一致，共2份樣品檢測結(jié)果不一致。敏感性性為94.59%(35/37)，特異性為100.00%(143/143)，總符合率為98.89%。

PRRSV多重RT-qPCR檢出陽性核酸41份，陰性139份；所建方法檢出PRRSV陽性核酸40份，陰性140份。其中份38陽性樣品、137份陰性樣品結(jié)果一致，共5份樣品結(jié)果不一致。敏感性為92.68%(38/41)，特異性為98.56%(137/139)，總符合率為97.22%(177/180)。CSFV與PRRSV混合感染4份，結(jié)果完全一致。

2.8 臨床應(yīng)用對2019年12月至2020年1月華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病診斷中心收到的來自湖北省、湖南省、江西省14家規(guī)?；i場的保育及育肥階段的839份抗凝血樣品進(jìn)行檢測。

在共計(jì)檢測樣品839份中，使用本研究建立的檢測方法，共檢出ASFV陽性核酸0份，陽性率0.00%；CSFV陽性核酸103份，陽性率12.28%；PRRSV陽性核酸249份，陽性率29.68%。混合感染份27，混合感染率3.22%(圖12)。

圖12 ASFV、CSFV、PRRSV及混合感染檢出率

3 討論

3.1 方法的建立本研究設(shè)計(jì)的通用型檢測方法，對可疑樣品進(jìn)行初步檢測，針對陽性樣品須再進(jìn)行測序依據(jù)基因組分析進(jìn)行分型[5-6]，這與目前大部分實(shí)驗(yàn)室檢測工作方向一致，并且本研究方法優(yōu)勢在于可檢測多種病原。本研究以國標(biāo)方法作為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，結(jié)果表明所建方法具有較高的敏感性。

CSFV 5′UTR序列保守性很高，常根據(jù)這一區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行感染CSFV的診斷工作。絕大多數(shù)已建立的RT-qPCR方案都使用高度保守的5′UTR作為CSFV檢測的目的基因[7]。本研究在設(shè)計(jì)引物時(shí)，參考了CSFV已報(bào)道的所有的亞型，從而盡可能地避免漏檢。在PRRSV基因組中，ORF6基因最為保守，其在歐洲型和美洲型毒株間同源性高于包括ORF7在內(nèi)的其他片段[8]，因此本研究選用ORF6作為PRRSV通用型檢測的候選目的基因。

3.2 檢測樣品的選擇對于ASFV、CSFV、PRRSV這3種病原的檢測來說，血液樣品以及組織樣品具有較高的病毒載量[9-12]，而口腔液樣品采樣更為便捷[13-15]。本研究在方法對比中選用了血液、口腔液和組織等樣品，可對比不同類型樣品檢測的效果，而在方法應(yīng)用中血液樣品則能更加真實(shí)地反映臨床情況。

3.3 方法對比為了最大限度驗(yàn)證本研究方法的可靠性，與國家標(biāo)準(zhǔn)方法或國家推薦診斷方法進(jìn)行了對比試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法具有較高的敏感性和特異性。而本研究方法的優(yōu)勢是可同時(shí)檢測3種病原，節(jié)省檢測的時(shí)間和成本。對于疾病凈化來說，漏檢可能引起嚴(yán)重的后果。本研究方法立足于通用型檢測，在具有較高靈敏性、特異性的同時(shí)，可檢測ASFV、CSFV、PRRSV各個(gè)亞型毒株，盡可能降低漏檢概率。

3.4 數(shù)據(jù)分析在對839個(gè)臨床樣品的檢測結(jié)果中，PRRSV檢出率最高達(dá)到29.68%，CSFV為12.28%，CSFV與PRRSV混合感染率為3.22%。

綜上所述，本研究建立了可以同時(shí)檢測ASFV、CSFV、PRRSV的多重qPCR方法，為用于臨床監(jiān)測、鑒別和凈化ASF、CSF、PRRS這3種豬病提供了有效支持。從臨床應(yīng)用中的結(jié)果整體來看，CSFV、PRRSV總核酸檢出率穩(wěn)定。