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一種CPPs介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法的建立及其應(yīng)用

2021-12-24 07:47:16閆可心閆宗斌韓金成薛書(shū)江于龍政宋建臣許應(yīng)天
關(guān)鍵詞:水浴菌液室溫

閆可心,閆宗斌,韓金成,薛書(shū)江,于龍政,宋建臣,許應(yīng)天

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)也稱為膜穿透肽(membrane penetrating peptide,MPPs)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(membrane transduction peptides,MTPs)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transductions,PTDs)[1]、“特洛伊木馬”肽(Trojan horse peptides) 或轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(transduction peptide) 等[2],是一類氨基酸數(shù)目為5~30 的小分子多肽。由于它可以運(yùn)載親水分子如核酸、肽、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)之后可降解,卻不會(huì)引起細(xì)胞損傷,而廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域[3-7],但至今尚未有有關(guān)基因轉(zhuǎn)化方面的報(bào)道。因此,本研究探討CPPs介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的可行性,為分子生物學(xué)中的基因轉(zhuǎn)化提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 血液樣本、載體和菌液瑟氏泰勒蟲(chóng)陽(yáng)性抗凝血采自吉林省琿春市天一牧場(chǎng),保存于本實(shí)驗(yàn)室。DH5α菌、BL21(DE3)菌、pET-30a(+)、pMD19-T simple vector均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑DNaseⅠ、ExTaq DNA聚合酶購(gòu)自TakaRa公司;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase Buffer、血液DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit Ⅰ)和凝膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit)均購(gòu)自O(shè)MEGA公司;廣譜蛋白marker、IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、考馬斯亮藍(lán)R-250、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶公司;其他為分析純?cè)噭?/p>

1.3 CPPs工作液的制備根據(jù)田菊等[8]報(bào)道的新型穿膜肽序列,委托北京博奧森公司合成。其細(xì)胞穿膜肽序列為:CGRLWMRWYSPWARRYGC。用ddH2O溶解CPPs,最終質(zhì)量濃度為2.35 g/L,分裝凍存于-20℃冰箱備用。

1.4 CPPs-DNA復(fù)合物最適比例將CPPs工作液與5 μL已知濃度的pMD19-T質(zhì)粒按照電荷比為0∶1,1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1,32∶1和64∶1混合[9],渦旋混勻,在室溫下孵育30 min,得到不同電荷比的CPPs復(fù)合物溶液。將CPPs復(fù)合物與10×loading Buffer混合,用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步確定CPPs與質(zhì)粒pMD19-T結(jié)合比例。按上述方法制備不同復(fù)合物,每個(gè)樣品加入5 U/μL DNase Ⅰ酶2,5 μL的10×DNase 1 Buffer后補(bǔ)充ddH2O至50 μL,在37℃孵育30 min,加終濃度為1%的SDS,用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析CPPs的親和力,最后確定CPPs和pMD19-T的最適比例。

1.5 CPPs-DNA復(fù)合物孵育溫度的優(yōu)化按前期試驗(yàn)優(yōu)化的條件制備CPPs-DNA復(fù)合物,分別在室溫、37℃、冰水浴條件下孵育30 min,復(fù)合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌液中,熱激法,即冰水浴30 min,42℃水浴75 s,立即冰水浴2 min,之后分別加入液體LB 400 μL,210 r/min搖菌1 h,留約100 μL的上清液重新吹打菌液,涂在含有氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。每個(gè)條件做3個(gè)重復(fù),計(jì)算轉(zhuǎn)化率,確定CPPs-DNA復(fù)合物制備條件。

轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化體總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量

轉(zhuǎn)化體總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積,

1.6 CPPs-DNA復(fù)合物孵育時(shí)間的優(yōu)化將上述優(yōu)化條件制備的電荷比為16∶1的CPPs-DNA復(fù)合物在室溫下分別孵育15,30,45,60 min,其他同1.5通過(guò)熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù),并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.7 大腸桿菌不同保存條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響培養(yǎng)3 h(D600約為0.6)的大腸桿菌菌液保存在4℃冰箱1,3,5,7 d和-20℃冰箱中保存7 d及3,6,12月,保存時(shí)加有終濃度為30 %的甘油,分別取菌液100 μL,加入電荷比為16∶1的CPPs-DNA復(fù)合物,其他同1.5通過(guò)熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,每組3個(gè)平行,計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.8 不同轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響-20℃保存的大腸桿菌DH5α菌液冰水浴解凍,加入電荷比為16∶1的CPPs-DNA復(fù)合物混勻后,分別在37℃下孵育15,30 min和室溫孵育15,30 min,分別加入液體LB 400 μL,210 r/min搖菌1 h,留約100 μL的上清液重新吹打菌液,涂在含有氨芐的固體LB培養(yǎng)基上,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。每組3個(gè)平行,計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.9 CPPs基因轉(zhuǎn)化法的應(yīng)用按照常規(guī)方法構(gòu)建牛瑟氏泰勒蟲(chóng)p33基因的克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒,其中2次轉(zhuǎn)化過(guò)程采用CPPs法進(jìn)行。

1.10 數(shù)據(jù)處理應(yīng)用Excel和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及平均數(shù)差異檢驗(yàn),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CPPs-DNA復(fù)合物的最適電荷比例CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T按不同電荷比混合后孵育30 min再進(jìn)行瓊脂凝膠電泳。結(jié)果顯示,當(dāng)CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T的電荷比大于8∶1時(shí),未見(jiàn) DNA 遷移條帶(圖1),表明 CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T 的最適電荷比8∶1。將上述復(fù)合物與DNaseⅠ酶孵育后,再加 1% SDS 溶液使 DNA 從復(fù)合物中釋放,進(jìn)行瓊脂凝膠分析CPPs的親和力。結(jié)果顯示,CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T 的電荷比為≥8∶1時(shí)可見(jiàn)完整的 DNA 遷移條帶(圖2) ,并且在16∶1最為明顯。綜合2種結(jié)果 CPPs 與質(zhì)粒pMD19-T最適電荷比為16∶1,且具有一定的保護(hù)作用。

M.DL 5000 DNA Marker;1~8.分別是CPPs與 DNA 按電荷比為 0,1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1,32∶1和64∶1混合孵育 30 min圖1 CPPs-DNA復(fù)合物的結(jié)合比例

M.DL 5000 DNA Marker;1~8.分別是CPPs與 DNA 按電荷比為0,1∶1,2∶1,4∶1,8∶1,16∶1,32∶1和64∶1混合孵育30 min后,再經(jīng)DNaseⅠ及1% SDS 處理;9.未經(jīng)DNaseⅠ處理的單純的質(zhì)粒 DNA圖2 CPPs-DNA復(fù)合物的親和力

2.2 CPPs-DNA復(fù)合物孵育溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響將CPPs與質(zhì)粒pMD19-T按照電荷比為16∶1的比例混合后,分別在室溫、37℃、冰水浴3個(gè)條件下孵育30 min,直接進(jìn)行熱激法轉(zhuǎn)化,并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示,CPPs-DNA復(fù)合物的孵育溫度對(duì)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的影響較大,室溫孵育時(shí)的轉(zhuǎn)化率最高,可達(dá)(6.81±0.68)×105CFU/μg,與37℃和冰水浴孵育時(shí)的轉(zhuǎn)化率有顯著性差異(P<0.01)。

表1 CPPs-DNA復(fù)合物不同孵育溫度的轉(zhuǎn)化率 ×105 CFU/μg

2.3 CPPs-DNA復(fù)合物的孵育時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率影響將CPPs-DNA復(fù)合物在室溫下分別孵育15,30,45和60 min,加到DH5α菌液中,熱激法,計(jì)算出平均轉(zhuǎn)化率,空白對(duì)照組沒(méi)有長(zhǎng)菌。由圖3可見(jiàn),當(dāng)復(fù)合物在室溫下孵育15min時(shí)轉(zhuǎn)化率很低,但孵育30 min 時(shí)轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到(8.87±0.40)×105CFU/μg,不同孵育時(shí)間有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且差異極顯著(P<0.01)。

2.4 大腸桿菌保存條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌DH5α菌液分別保存在4℃冰箱1,3,5和7 d;-20℃冰箱中保存7 d及3,6,12月,之后取出放在冰水中,各加入現(xiàn)制備的CPPs-DNA復(fù)合物,熱激法轉(zhuǎn)化計(jì)算轉(zhuǎn)化率。從圖4可以看出,大腸桿菌菌在4℃冰箱只能保存1 d,而在-20℃冰箱保存3月的轉(zhuǎn)化率可達(dá)(5.58±0.19)×105CFU/μg,仍達(dá)到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求。

圖4 大腸桿菌保存在-20℃時(shí)的轉(zhuǎn)化率

2.5 大腸桿菌解凍溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響-20℃冰箱取出的大腸桿菌菌液,分別在室溫、冰水浴、37℃溫度下解凍,之后將室溫下孵育30 min現(xiàn)制備的CPPs-DNA復(fù)合物加到DH5α菌液中,進(jìn)行轉(zhuǎn)化,并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如表2所示,-20℃冰箱取出的大腸桿菌菌液通過(guò)冰水浴解凍后平均轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到(10.71±1.99)×105CFU/μg,DH5α菌液在不同溫度下解凍有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且差異極顯著(P<0.01)。

表2 大腸桿菌解凍溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 ×105 CFU/μg

2.6 轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響復(fù)合物在室溫下孵育30 min后分別轉(zhuǎn)到冰水浴解凍的-20℃保存的大腸桿菌DH5α菌液中,混勻后,不再用熱激法,而是分別在37℃下孵育15,30min和室溫孵育15,30 min,之后計(jì)算轉(zhuǎn)化率。如表3顯示,復(fù)合物加入到菌液后在37℃下孵育15,30 min,其轉(zhuǎn)化率均未達(dá)到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求,而在室溫孵育15 min 其轉(zhuǎn)化率已達(dá)到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求,30 min時(shí)的轉(zhuǎn)化率高達(dá)(7.85±0.51)×105CFU/μg,與其他組差異顯著(P<0.05)。

表3 轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 ×105 CFU/μg

2.7 CPPs基因轉(zhuǎn)化法的應(yīng)用按照所優(yōu)化的CPPs基因轉(zhuǎn)化法將常規(guī)PCR擴(kuò)增出的目的片段(圖5)克隆到pMD19-T載體,獲得的重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-p33經(jīng)PCR擴(kuò)增和EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切出預(yù)期大小的片段(圖6),說(shuō)明目的基因成功擴(kuò)增并插入到pMD19-T中。測(cè)序結(jié)果表明,克隆得到的牛瑟氏泰勒蟲(chóng)p33基因片段長(zhǎng)786 bp,與GenBank上序列同源性為99.0%。

按常規(guī)法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-p33,經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切得到預(yù)期大小的條帶,證明目的基因已經(jīng)定向插入表達(dá)載體pET-30a中。

M.DL2000 DNA Marker;1.水對(duì)照;2.p33基因的擴(kuò)增產(chǎn)物圖5 p33基因的PCR擴(kuò)增

M.DL2000 DNA Marker;1.pMD19-T-p33的酶切產(chǎn)物;2.未經(jīng)酶切的pMD19-T-p33圖6 重組質(zhì)粒pMD19-T-p33的雙酶切鑒定圖

3 討論

在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中DNA 重組技術(shù)和基因表達(dá)是最常用的研究方法,這些研究中DNA連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化是關(guān)鍵步驟[10]。而常規(guī)基因轉(zhuǎn)化需要制備大量的感受態(tài)細(xì)胞,CaCl2法是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的制備方法。其原理是Ca2+與細(xì)胞膜上的多聚無(wú)機(jī)磷酸和多聚羥基丁酸化合物結(jié)合形成復(fù)合物,進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)雙分子層,使得外源DNA更易滲入[10],CaCl2法轉(zhuǎn)化率較高,但是存在繁瑣的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、超低溫保存和轉(zhuǎn)化率不穩(wěn)定等問(wèn)題[11]。為了彌補(bǔ)這些不足點(diǎn),本研究探討了CPPs在常規(guī)基因轉(zhuǎn)化方面應(yīng)用的可行性。

細(xì)胞穿膜肽是一種具有穿膜活性的非病毒載體,可以攜帶各種大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并保持其生物活性,是一種具有廣闊前景的運(yùn)輸載體[2]。雖然CPPs如何作用于細(xì)胞質(zhì)膜,以及如何穿透質(zhì)量膜的機(jī)制目前還不是十分清楚,但其在分子生物學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域誘人的應(yīng)用前景卻是毋庸置疑的。研究發(fā)現(xiàn),將CPPs與一些DNA混合后,CPPs作為有效的基因靶腦載體介導(dǎo)核酸進(jìn)入細(xì)胞后,從溶酶體逃逸,完成輸送物質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)[7]。細(xì)胞穿膜肽有天然的,也有人工合成的。根據(jù)KAMIDE等[12]報(bào)道細(xì)胞穿膜肽序列中的精氨酸取代第一個(gè)賴氨酸時(shí)其穿膜能力會(huì)增加,將 2 個(gè)蘇氨酸更換成色氨酸和丙氨酸有利于穿膜作用。因此,本研究參考田菊等[8]報(bào)道的穿膜肽序列人工合成穿膜肽開(kāi)展了本研究。

質(zhì)粒 DNA 從CPPs-/DNA 復(fù)合物中有效、適時(shí)地釋放出來(lái)是其基因轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵因素,兩者的親和力太低就會(huì)導(dǎo)致 DNA 提前釋放或被 DNA 酶等水解[13]。本研究用瓊脂糖凝膠電泳和DNaseⅠ酶探討了CPPs-DNA復(fù)合物最適電荷比例。結(jié)果表明,CPPs-DNA最適電荷比為16∶1。在最適制備條件的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn),室溫、37℃和冰水浴3個(gè)條件中只有室溫孵育30 min時(shí)其轉(zhuǎn)化率達(dá)到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求,說(shuō)明孵育溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率有顯著影響,該結(jié)果與田菊等[8]報(bào)道一致。在大腸桿菌保存條件的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn),-4℃冰箱保存時(shí)只能保存1 d,而-20℃冰箱保存3月時(shí)的其轉(zhuǎn)化率仍達(dá)到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求。在轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化中發(fā)現(xiàn),37℃孵育的轉(zhuǎn)化率仍未達(dá)到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求,而室溫孵育15 min的轉(zhuǎn)化率也達(dá)到常規(guī)轉(zhuǎn)化要求,30 min時(shí)的轉(zhuǎn)化率更好,為(7.85±0.51)×105CFU/μg,該結(jié)果與CPPs-DNA最適制備條件優(yōu)化結(jié)果一致。本研究首次成功將CPPs基因轉(zhuǎn)化法應(yīng)用到牛瑟氏泰勒蟲(chóng)p33基因可質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。目前公認(rèn)的細(xì)胞穿膜肽的穿膜細(xì)胞機(jī)制有多種。一種是穿膜肽與小分子結(jié)合后通過(guò)靜電作用和形成氫鍵的易位或轉(zhuǎn)導(dǎo)作用進(jìn)入細(xì)胞;另一種是穿膜肽與大分子結(jié)合后通過(guò)能量依賴的內(nèi)吞作用,特別是巨胞飲作用內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞[14]。認(rèn)為,本研究中CPPs基因轉(zhuǎn)化法的可能是第一種機(jī)制。因?yàn)榇蟛糠諧PPs由堿性氨基酸組成,帶正電荷的CPPs可以和帶負(fù)電荷的DNA在一定電荷比條件下混合,靜電相互作用而形成CPPs-DNA 復(fù)合物,形成的復(fù)合物便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),表達(dá)所攜帶的目的基因[15]。雖然本研究探討了CPPs-DNA復(fù)合物的制備條件以及轉(zhuǎn)化條件,但由于至今其確切的作用機(jī)制尚不十分清楚,其影響因素有待進(jìn)一步深入探討。

總之,CPPs介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的最佳條件為現(xiàn)制備的CPPs-DNA復(fù)合物電荷比為16∶1,室溫孵育30 min,熱激法加入到-20℃保存用冰水浴解凍的的大腸桿菌菌液中,無(wú)需制備感受態(tài)細(xì)胞。本研究首次成功將CPPs基因轉(zhuǎn)化法應(yīng)用到牛瑟氏泰勒蟲(chóng)p33基因克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。該結(jié)果將分子生物學(xué)基因轉(zhuǎn)化提供了一種新方法,也為CPPs的應(yīng)用開(kāi)辟了新的思路。

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