崔 嘉，吳峰洋， 楊新宇，樊長林， 陳寶江,3*

(1.河北農業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071000；2.保定市動物檢疫隊，河北 保定 071001；3.河北省牛羊胚胎技術創(chuàng)新中心，河北 保定 071000)

氨氣(NH3)是兔舍中主要的有害氣體之一，兔舍中氨氣濃度一般為2.28～38.00 mg/m3,且大多數兔舍氨氣濃度可達7.6 mg/m3[1-2]。環(huán)境中高濃度的氨氣會增加器官和組織中氨的濃度[3]，并引起許多不利影響，包括生長減緩[4]、代謝異常[5]、免疫抑制[6]、組織和器官損傷[7]以及生殖功能損傷等[8-9]。卵巢是主要的生殖器官，負責產生成功受精和早期胚胎發(fā)育所需的感受態(tài)卵母細胞[10]。研究發(fā)現(xiàn)，7.6,57.0 mg/m3的氨氣可顯著降低產蛋鴨的卵巢質量及產蛋率[4]。50,100 mg/m3的氨氣環(huán)境會降低雞只的產蛋率[11]。12.92～19.00 mg/m3氨氣會顯著降低大小鼠的產仔量、仔鼠的初生體質量、仔鼠的離乳率及胎次間隔[12]。目前，關于整個卵巢的研究越來越多[13-14]。吳夢等[15]通過對武定雞卵巢轉錄組SNP進行分析發(fā)現(xiàn)，與繁殖相關的GnRH信號通路中的 PLA2G4A和MAPK12基因可能與武定雞的停產和產蛋有密切關系。張杉杉[16]通過Illumina 測序平臺對高產、低產番鴨卵巢組織進行轉錄組測序，篩選出了7個與繁殖性狀相關的關鍵基因。吳賢鋒等[17]利用RNA-Seq技術獲得了不同品種山羊不同繁殖性狀的基因表達模式。

卵巢作為一個動態(tài)發(fā)育的生殖器官，卵母細胞和周圍卵丘細胞(CC)之間通過間隙連接的雙向通訊對于卵泡區(qū)的發(fā)育和卵母細胞能力的獲得至關重要[14]。因此，將卵丘-卵母細胞復合體(COCs)視為相互依賴的區(qū)室的研究非常重要。趙智鋒等[18]通過比較川中黑山羊和雷州山羊大小卵泡的mRNA表達圖譜，發(fā)現(xiàn)GADD45B、TC2和MSMO基因與卵泡發(fā)育密切相關。陸婷婷等[19]采用高通量測序技術對發(fā)情期川中黑山羊的卵巢基質、大卵泡和小卵泡進行轉錄組測序，篩選出INHA、TNFRSF19等15個與卵泡發(fā)育相關的基因，主要富集在內質網蛋白質加工、類固醇生物合成、卵母細胞減數分裂等信號通路。謝夢圓等[20]采用Illumina測序技術對添加OrexinA的黃體顆粒細胞進行測序后發(fā)現(xiàn)，cGMP-PKG信號通路可能在OrexinA調控綿羊卵巢黃體化顆粒細胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。兔具有“不爭地、少爭糧、易管理”等優(yōu)點,且多胎高產,因此使其卵巢保持活躍狀態(tài)從而促進卵泡發(fā)育、誘導母兔發(fā)情，對肉兔的繁殖具有重要作用，然而關于氨氣對肉兔的卵丘卵母細胞轉錄組研究鮮見報道。

本研究以肉兔為研究對象，應用高通量測序技術對COCs進行轉錄組測序，比較分析氨氣對COCs的差異表達基因，揭示氨氣對COCs的毒性機理，為氨氣影響肉兔繁殖性能相關候選基因篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計將100只體質量為(1 311.15±144.69) g的35日齡雌性IRA肉兔隨機分為CG和LAC兩組，分別置于氨氣濃度為0.0,7.6 mg/m3的環(huán)境控制倉中，每組50個重復，每個重復1只，單籠飼養(yǎng)。自由飲水和采食，光周期為12L∶12D，倉內溫度為18～24℃，試驗期28 d。

1.2 樣品采集試驗結束后，稱肉兔活體質量，每組隨機選取10只肉兔用電擊方法實施安樂死。取卵巢，并用含雙抗的生理鹽水清洗3次，用剪刀剪去卵巢多余組織，用一次性注射器抽取卵巢表面卵泡，撿出COCs，迅速放置于液氮保存。

1.3 卵巢組織學觀察卵巢組織經過脫水透明、浸蠟、包埋、載玻片明膠處理、切片、貼片、烤片、脫蠟、HE染色與封片等步驟后得到組織石蠟切片。將石蠟切片置于光學顯微鏡下拍照，觀察組織結構變化并對不同級別卵泡計數。

1.4 RNA文庫的構建和測序按照制造商的程序，使用Trizol試劑(Invitrogen，CA，USA)提取總RNA。使用RIN數>7.0的Bioanalyzer 2100和RNA 6000 Nano LabChip試劑盒(Agilent,CA,USA)分析總RNA數量和純度。根據Epicenter Ribo-Zero Gold Kit(Illumina,San Diego,USA)的說明，純化RNA。純化后，在高溫下使用二價陽離子將poly(A)-或poly(A)+RNA片段裂解。然后，按照mRNA-Seq樣品制備試劑盒(Illumina,San Diego,USA)的操作規(guī)程，將裂解的RNA片段反轉錄以創(chuàng)建最終的cDNA文庫，配對末端文庫的平均片段大小為300 bp (±50 bp)。然后，按照說明在Illumina NovaseqTM6000(lc-bio,China)上進行配對末端測序。首先，使用Cutadapt除去低質量堿基和不確定堿基的片段，然后使用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)驗證序列質量。使用Bowtie2和hisat2將片段映射到兔的基因組，用StringTie組裝每個樣品的映射片段，用StringTie和edgeR評估所有轉錄本的表達水平。

1.5 定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)驗證提取樣本中總RNA后用超微量核酸蛋白測定儀(Scandrop100)檢測總RNAD值，計算D260/D280比值。采用Aidlab公司反轉錄試劑盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit)進行反轉錄操作。采用20 μL反應體系：總RNA 500 ng，5×RT Reaction Mix 4 μL，Rondam primer/oligodT 1 μL，TUREscript H-RTase/RI Mix 1 μL，加RNase Free dH2O至20 μL。反轉錄反應條件如下：25℃ 10 min，42℃ 50 min，65℃ 15 min反應結束后，得到cDNA，-80℃保存。Real-time PCR反應熒光定量反應體系：2×SYBR?Green Supermix(5 μL),Forward primer(0.5 μL)，Reverse primer(0.5 μL),cDNA(1 μL)，ddH2O(3 μL)。擴增條件：95℃預變性5 min；循環(huán)反應95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；融解曲線95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。引物序列見表1。

表1 本試驗中使用的引物信息

1.6 統(tǒng)計分析使用SPSS 23.0通過One-Way ANOVA和LSD對所有試驗數據進行統(tǒng)計分析。數據表示為平均值±標準差。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 氨氣對肉兔卵巢組織形態(tài)的影響由圖1可知，氨氣刺激后肉兔卵巢卵泡腔塌陷，卵泡細胞壞死脫落于卵泡腔，部分壞死細胞核溶解凝固。與對照組相比，原始卵泡與初級卵泡數量極顯著降低(P<0.01)，閉鎖卵泡增多(P>0.05)。

2.2 COCs差異表達基因的篩選采用DEseq2法篩選DEGs，與CG組(對照組)相比，LAC組(處理組)COCs共有3 345個顯著差異表達基因，其中顯著上調DEGs 1 093個，顯著下調DEGs 2 252個。表2列出了氨氣處理后上調倍數最大的前20個DEGs，表3列出了氨氣處理后下調的20個DEGs。

A.CG組卵巢的組織形態(tài)(100×)；B.LAC組卵巢的組織形態(tài)(100×)；C.卵巢組織各級卵泡數。黑色箭頭(↑)表示原始卵泡；紅色箭頭(↑)表示初級卵泡；綠色箭頭(↑)表示次級卵泡；藍色箭頭(↑)表示卵泡狀卵泡;*,**.分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01);CG.0.0 mg/m3氨氣；LAC.7.6 mg/m3氨氣圖1 氨氣對肉兔卵巢組織形態(tài)的影響

表2 COCs中上調倍數最大的前20個差異表達基因

表3 COCs中下調倍數最大的前20個差異表達基因

2.3 差異表達基因的GO功能富集分析GO分析結果顯示，3 345個DEGs歸類涉及生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3大類49個二級條目(圖 2)。在生物過程分類25個二級條目中占比例最大依次為以DNA為模板的轉錄調控(regulation of transcription,DNA-templated)、DNA為模板的轉錄(transcription,DNA-templated)、GTPase活性的正向調節(jié)(positive regulation of GTPase activity)和蛋白質磷酸化(protein phosphorylation)。在細胞組分分類15個二級條目中占比例最高依次為細胞質(cytoplasm)、核(nucleus)、胞質溶膠(cytosol)及核質(nucleoplasm)。在 分子功能分類10個二級條目中占比例最大的依次為蛋白質結合(protein binding)、金屬離子結合(metalion binding)、ATP 結合(ATP binding)及DNA 結合(DNA binding)。

圖2 mRNAs的GO功能注釋

2.4 差異表達基因KEGG通路分析KEGG通路分析結果顯示，3 345個DEGs被富集到316條KEGG通路，其中PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、Hippo信號通路(Hippo signaling pathway)、 FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)和TGF-beta信號通路(TGF-beta signaling pathway)等31條通路為顯著富集，各信號通路的基因調控關系見圖3。

A.mRNAs的KEGG分析;B.PI3K-Akt信號通路;C.Rap1信號通路;D.Hippo信號通路;E.FOXO信號通路;F.TGF-beta信號通路圖3 KEGG通路富集分析及蛋白互作網絡

2.5 q-PCR驗證采用qRT-PCR驗證5個DEGs的轉錄水平(圖4)， 結果表明，通過qRT-PCR確定所選DEGs的表達模式與通過RNA-Seq的表達模式一致，表明通過RNA-seq確定的DEGs的表達譜是可靠和準確的。

圖4 部分差異表達基因的結果

3 討論

卵巢最基本的結構與功能的單位是卵泡，它們的數量與質量直接決定了卵巢的功能與壽命[21]。卵泡的發(fā)育實際上是卵母細胞和周圍的顆粒細胞及卵泡膜細胞互相調控的過程，卵泡的形態(tài)和功能也隨著發(fā)育時間而不斷變化，卵泡閉鎖的潛在機制之一就是顆粒細胞凋亡[22-23]。本試驗結果顯示，氨氣處理后肉兔卵巢的完整性被破壞，原始卵泡與初級卵泡數量極顯著降低(P<0.01),閉鎖卵泡增多(P>0.05)。卵泡數量的顯著降低及閉鎖卵泡的數量增多表明氨氣損傷了卵巢影響了其功能與壽命。

SIRT1、KIRREL和IGFBP2均是與繁殖相關的基因。SIRT1在生殖細胞和體細胞中均有表達，參與機體多項生理過程[24]，并通過影響細胞自噬和推動顆粒細胞凋亡來調控卵泡發(fā)育，在遺傳毒性、氧化或代謝脅迫下，SIRT1活性增加[25]。KIRREL存在于不同的卵巢細胞中，在顆粒細胞中表達較高，KIRREL與顆粒細胞中MAPK1/3和MAPK14磷酸化的快速增加致使細胞增殖，通過MAPK信號通路對黃體化顆粒細胞產生影響[26]。IGFBP2屬于IGFBPs家族的重要成員之一，具有多種生物學功能，在卵泡閉鎖時表達水平顯著提高[27]。本試驗結果顯示，氨氣處理后的COCs中SIRT1、KIRREL和IGFBP2等基因表達上調，從而影響顆粒細胞的發(fā)育能力，促進顆粒細胞凋亡。

Pik3r1主要是通過PI3K-AKT-mTOR信號途徑促進基質細胞增殖、抑制細胞凋亡,參與調控胚胎植入[28]。在卵丘顆粒細胞中,KDM2B基因的表達水平隨減數分裂的進行而顯著增加[29]。LHCGR主要通過改變卵泡類固醇激素生成來影響卵泡的發(fā)育[32]。LHCGR接受LH信號開啟腺苷酸-蛋白激酶(Camp/PKA)信號通路，激活下游類固醇生成[30]，并通過抑制BMP細胞因子來促進卵泡發(fā)育[31]。本試驗結果表明，氨氣處理后的COCs中Pik3r1、KDM2B和LHCGR等基因表達下調，影響類固醇激素生成，促進顆粒細胞凋亡，從而影響卵泡發(fā)育。

卵泡的發(fā)育過程由原始卵泡的啟動開始。原始卵泡啟動機制可能與卵泡內外分泌的各種因子、神經遞質或卵母細胞-顆粒細胞間的信號傳遞等有關[33]。本試驗中GO功能注釋發(fā)現(xiàn)，COCs差異表達的基因在生物過程主要富集在DNA轉錄調控、DNA模板,細胞組分主要富集在細胞質、核、胞質溶膠成分，分子功能主要富集在各種物質的結合；這表明氨氣會影響卵丘卵母細胞形態(tài)結構，影響卵丘卵母細胞之間的物質交換及信號傳遞。

卵泡中的卵母細胞周圍包裹著各種體細胞，體細胞合成的相關激素物質會通過卵泡液運送到卵母細胞中，以調控和促進卵母細胞的發(fā)育成熟和啟動減數分裂[34-35]。本試驗中對差異基因進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，氨氣處理組與對照組COCs中細胞周期(cell cycle)、緊密連接(tight junction)、胞吞作用(endocytosis)、細胞衰老(cellular senescence)、卵母細胞減數分裂(oocyte meiosis)與孕激素介導的卵母細胞成熟(proge oocyte maturation)通路上的基因表達發(fā)生顯著變化；這表明氨氣處理后COCs中卵母細胞的發(fā)育成熟及減數分裂受到影響。

本試驗發(fā)現(xiàn)，氨氣處理后差異表達基因顯著富集于PI3K-Akt、Rap1、Hippo、FoxO和TGF-beta信號通路，這些信號通路參與細胞增殖和分化[20]、激素調節(jié)等功能[36]。在卵泡中PI3K/AKT-β-catenin信號通路的調控參與FSH以及WNT2介導的卵母細胞和顆粒細胞間細胞連接的形成和解離[37]，通路激活會減少顆粒細胞和卵母細胞間連接從而加速卵泡閉鎖[38]。Hippo信號通路在調控卵巢顆粒細胞(GCs)與雌性生殖干細胞(female germ stem cells,FGSCs)增殖中均發(fā)揮了重要作用[39-41]。FOXO3a可能通過SCF-PI3K-FOXO3a-p27kip1/Bim通路介入新生大鼠卵巢中裸露卵母細胞及原始卵泡卵母細胞凋亡的調節(jié)[42]。FOXO3a可能同步誘導促凋亡蛋白Bim和FasL高表達，激活下游細胞凋亡途徑，并引起卵母細胞凋亡[43]。TGF-beta信號通路可影響動物卵巢內卵泡的發(fā)育調節(jié)過程[44]。由此推測，氨氣通過激活這些信號通路來影響卵母細胞及顆粒細胞的發(fā)育以調控卵丘卵母細胞的增殖與凋亡。

本試驗結果表明氨氣處理導致肉兔卵巢組織結構完整性被破壞，卵巢儲備能力降低。氨氣影響肉兔COCs轉錄組，通過調節(jié)SIRT1、KIRREL、IGFBP2、Pik3r1、KDM2B和LHCGR等影響卵丘卵母細胞發(fā)育及功能的基因，激活PI3K-Akt、Rap1、Hippo、FoxO和TGF-beta信號通路影響卵母細胞及顆粒細胞的發(fā)育，促進卵丘卵母細胞凋亡，進而抑制卵泡發(fā)育并影響肉兔卵巢正常功能發(fā)揮，最終導致繁殖性能降低。