瞿昊宇，謝夢(mèng)洲，陳光宇*，何 群

(1.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

藁本為傘形科植物藁本LigusticumsinenseOliv.或遼藁本LigusticumjeholenseN akai et Kitag.的干燥根莖及根，有散風(fēng)寒濕邪之功效，主治風(fēng)寒頭痛、巔頂痛、寒濕腹痛、泄瀉、癥瘕、疥癬等，性味辛、溫，入膀胱經(jīng)[1-2]，用藥歷史悠久，以飲片入藥。阿魏酸是藁本中的主要活性成分，而且在20個(gè)產(chǎn)地中均含有，可以作為評(píng)價(jià)藁本藥材質(zhì)量的活性成分[3-4]。研究表明阿魏酸具有抗血小板聚集、抑制血小板5-羥色胺釋放、抑制血小板血栓素A2(TXA2)的生成和增強(qiáng)前列腺素活性等作用，同時(shí)還有報(bào)道表明阿魏酸具有鎮(zhèn)痛和緩解血管痙攣等作用[5-6]，它同時(shí)在人體中可起到健美和保護(hù)皮膚的作用[7]。遼藁本質(zhì)量屬性(阿魏酸含量、揮發(fā)油含量、浸出物含量等)優(yōu)于藁本[8-9]。(2020年版《中國(guó)藥典》一部)對(duì)藁本藥材及飲片項(xiàng)下規(guī)定了性狀、鑒別、檢查、浸出物、含量測(cè)定等，未規(guī)定指紋圖譜檢測(cè)[10-11]。但僅從已有的檢測(cè)項(xiàng)目無(wú)法全面控制藁本藥材及飲片的質(zhì)量，研究其單體成分并不能洞悉藁本功效的全貌，不能全面反映藁本炮制前后質(zhì)量屬性的改變，從而影響藁本藥材及飲片的質(zhì)量控制及質(zhì)量評(píng)價(jià)。故為比較遼藁本炮制前后化學(xué)成分的變化及質(zhì)量傳遞信息，評(píng)價(jià)遼藁本藥材及飲片的質(zhì)量屬性，本文通過(guò)研究遼藁本炮制前后指紋圖譜的改變，為遼藁本藥材及飲片質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)，為確保遼藁本飲片的質(zhì)量與療效，考察與評(píng)價(jià)從遼藁本藥材-飲片質(zhì)量屬性變化提供依據(jù)。目前，國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道藁本藥材或飲片的指紋圖譜研究，但其方法未被法典收載，對(duì)于量質(zhì)傳遞研究還欠依據(jù)。本研究基于液相色譜法，對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的藁本指紋圖譜研究進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)指紋圖譜驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)藁本指紋圖譜峰進(jìn)行辨認(rèn)，為藁本藥材-飲片量值傳遞提供依據(jù)。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；包括G1316A四元梯度泵，G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A恒溫箱，G1314A紫外檢測(cè)器，Agilent Chemstation 色譜工作站)；中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TCS-100型電子臺(tái)秤(上海乾峰電子儀器有限公司)；PW135型中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；SHH.W21電子三用水箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；QY-1中藥切片機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司)；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.2 藥材及試劑

遼藁本各批原藥材經(jīng)王智老師鑒定為傘形科植物遼藁本LigusticumjeholenseNakai et Kitag.的干燥根莖和根；遼藁本各批飲片，由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)優(yōu)化炮制工藝參數(shù)，按最佳炮制工藝制備飲片；阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)：110773-201614)，規(guī)格：50 mg，純度：不少于99.0%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，供含量測(cè)定用；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水；液相色譜柱(月旭，Ultimate? XB-C18，4.6 mm×250 mm，5μm)。

2 方法與結(jié)果

2.1 遼藁本飲片的制備

首先將遼藁本藥材除雜質(zhì)泥沙，除去蒂頭須根，剔除異物，淋洗22 min，瀝干，切3～4 mm厚片，鋪層(堆放)2 cm厚，50～60 ℃鼓風(fēng)干燥，翻動(dòng)1次。

2.2 遼藁本指紋圖譜測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[5-6]液相色譜柱(以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，月旭公司Ultimate XB-C18型，5μm，4.6×250 mm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相；梯度洗脫(0～15 min，10%→20%A；15～60 min，20%→85%A；60～65 min，85%→10%A；65～70 min，10%A)；流速：1.9 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為304 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10μL，理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。

2.2.2 阿魏酸對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸約10 mg，精密稱定，置于10 mL棕色容量瓶中，精密加入70%甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含阿魏酸1.13 mg的阿魏酸對(duì)照品濃溶液1，精密移取1 mL阿魏酸對(duì)照品濃溶液1置10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含阿魏酸0.113 mg的對(duì)照品濃溶液2，精密移取2 mL阿魏酸對(duì)照品濃溶液2于10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含阿魏酸22.6μg的對(duì)照品溶液，過(guò)0.22μm微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中，即得。

2.2.3 供試品溶液制備的基本方法 取各批遼藁本藥材及飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50.0 mL，密塞，稱定重量，置超聲波提取器中超聲60 min(250 W，50 Hz)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取10 mL上清液離心7 min，取上清液，過(guò)0.22μm微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照供試品溶液的制備 取缺遼藁本藥材樣品的流動(dòng)相溶劑(甲醇)，按“2.2.3”同法制備，即得陰性供試品溶液。

2.3 遼藁本指紋圖譜分析方法驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測(cè)指紋圖譜峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值大體一致，阿魏酸色譜峰面積RSD=1.638%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按供試品溶液的制備法制備成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定其色譜圖，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值大體一致，阿魏酸色譜峰面積RSD=2.437%(n=6)，表明本分析方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48、72 h進(jìn)樣，測(cè)定其HPLC譜圖，各共有峰相+對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值基本一致，阿魏酸色譜峰面積RSD=2.826%(n=6)，表明本分析方法的穩(wěn)定性良好，供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 遼藁本藥材及飲片指紋圖譜的建立

將GB-01、02、03、04、05、06、07、08、09、10、11、12、13、14、15共15批遼藁本藥材及飲片色譜圖的cdf格式文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版》軟件中，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.130723版本”軟件進(jìn)行分析，設(shè)定遼藁本藥材GB-01及飲片GB-01色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行全譜峰匹配，結(jié)果見圖1，圖2，生成遼藁本藥材對(duì)照特征圖譜(43個(gè)共有峰，篩選后有6個(gè)共有峰，見圖3)及遼藁本飲片對(duì)照特征圖譜(原有38個(gè)共有峰，篩選后有6個(gè)共有峰，見圖4)。陰性對(duì)照品溶液(甲醇空白)見圖5，阿魏酸對(duì)照品溶液見圖6，遼藁本藥材供試液指紋圖譜見圖7，遼藁本飲片供試液指紋圖譜見圖8，各批藥材供試品對(duì)照特征圖譜相似度見表1。各批飲片供試品對(duì)照特征圖譜相似度見表2。

表1 15批遼藁本藥材HPLC指紋圖譜相似度

表2 15批遼藁本飲片HPLC指紋圖譜相似度

圖1 15批遼藁本藥材指紋圖譜

圖2 15批遼藁本飲片指紋圖譜

圖3 遼藁本藥材對(duì)照特征圖譜

圖4 遼藁本飲片對(duì)照特征圖譜

圖5 陰性對(duì)照品指紋圖譜

圖6 阿魏酸對(duì)照品指紋圖譜

圖7 遼藁本藥材GB-01指紋圖譜

圖8 遼藁本飲片GB-01指紋圖譜

根據(jù)15批遼藁本藥材指紋圖譜匹配結(jié)果，可匹配成功43個(gè)共有峰，經(jīng)過(guò)篩選可得6個(gè)共有峰。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品對(duì)比標(biāo)定出1個(gè)色譜峰，為2號(hào)(阿魏酸)。

根據(jù)15批遼藁本飲片指紋圖譜匹配結(jié)果，可匹配成功38個(gè)共有峰，經(jīng)過(guò)篩選可得6個(gè)共有峰。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品對(duì)比標(biāo)定出1個(gè)色譜峰，為2號(hào)(阿魏酸)。

遼藁本藥材各指紋圖譜相似度值皆大于0.9，故可以遼藁本藥材指紋圖譜相似度不低于0.9作為遼藁本藥材指紋圖譜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

遼藁本飲片各指紋圖譜相似度值皆大于0.9，故可以遼藁本飲片指紋圖譜相似度不低于0.9作為遼藁本飲片指紋圖譜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)15批遼藁本藥材和飲片指紋圖譜相似度進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，得均值差異檢驗(yàn)t=0.239 4，df=14，P=0.814 3，結(jié)果表明遼藁本藥材和飲片指紋圖譜大體一致，遼藁本炮制前后其化學(xué)成分變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

藁本有藁本和遼藁本兩個(gè)基原，前期研究表明遼藁本質(zhì)量?jī)?yōu)于藁本，藁本藥材大多不符合《中國(guó)藥典》(2015版一部380頁(yè))藁本項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定，故本實(shí)驗(yàn)選用遼藁本研究其炮制前后的指紋圖譜。

本文采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版》 規(guī)定的相似度計(jì)算法對(duì)15批遼藁本藥材及飲片的指紋圖譜進(jìn)行分析結(jié)果較好。

遼藁本含揮發(fā)油、阿魏酸等對(duì)熱不穩(wěn)定的有效成分，盡管優(yōu)化了炮制工藝參數(shù)，但炮制過(guò)程中仍然有少部分損失，15批遼藁本藥材指紋圖譜可匹配成功43個(gè)共有峰，15批遼藁本飲片指紋圖譜匹配結(jié)果，可匹配成功38個(gè)共有峰，比藥材少了5個(gè)峰，說(shuō)明含量低的成分在炮制過(guò)程中損失了，但整體來(lái)說(shuō)，遼藁本炮制前后其化學(xué)成分變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。