王潔，朱麗華，陳林君，林飛，刁振宇，徐志鵬，王珊珊，張寧媛

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210000)

成骨不全癥(Osteogenesis imperfecta，OI)是一種罕見(jiàn)的系統(tǒng)性結(jié)締組織疾病，其特征是骨密度較低、骨質(zhì)脆弱、復(fù)發(fā)性骨折和進(jìn)行性骨畸形，也可表現(xiàn)為關(guān)節(jié)松弛、藍(lán)鞏膜和耳聾等[1-2]。OI具有遺傳異質(zhì)性，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳或伴X染色體遺傳[3]。OI的發(fā)病率約為1/10 000，其中約90%的發(fā)病屬于由編碼Ⅰ型膠原蛋白的COL1A1/COL1A2基因的雜合突變導(dǎo)致膠原形成障礙的常染色體顯性遺傳病[4-6]。

目前OI還沒(méi)有特別有效的治療方法，因此針對(duì)攜帶致病突變的家系開展胚胎植入前單基因病遺傳學(xué)檢測(cè)(Preimplantation genetic testing for monogenic/single gene defects，PGT-M)是最好的應(yīng)對(duì)策略。另外，PGT-M能夠篩選出基因型正常的胚胎，可以避免等到產(chǎn)檢發(fā)現(xiàn)致病突變而終止妊娠給母體帶來(lái)的身心創(chuàng)傷。在PGT-M中，應(yīng)用基于二代測(cè)序(Next generation sequencing，NGS)的單體型分析，既可以將致病基因所在的染色體與其同源染色體區(qū)分開，又可以避免由直接檢測(cè)中等位基因脫扣(Allele dropout，ADO)或重組導(dǎo)致的誤診，對(duì)常染色體顯性遺傳病的PGT-M具有重要的臨床意義[7-9]。對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行一代測(cè)序再聯(lián)合基于NGS的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)單體型分析技術(shù)能提高胚胎期檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，顯著降低誤診率[10-11]。并且，在PGT-M的SNP單體型分析中，先證者、溯源的家系樣本、無(wú)法溯源家系的患者或新發(fā)突變患者的配子或胚胎的遺傳信息均可以用于連鎖分析[12-13]。因此，不同SNP單體型分析策略能適用于更多類型的患者。

本研究通過(guò)NGS檢測(cè)3個(gè)攜帶了COL1A1致病突變的家系，分別采用先證者、家系樣本和單精子的遺傳信息構(gòu)建SNP單體型，聯(lián)合對(duì)突變位點(diǎn)的直接測(cè)序，對(duì)家系囊胚行PGT-M，探討其在阻斷OI遺傳缺陷縱向傳遞的有效性。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2016年1月至2020年12月于本生殖醫(yī)學(xué)中心就診并接受遺傳咨詢和輔助生殖助孕的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻雙方中至少一方攜帶COL1A1基因致病突變，經(jīng)診斷為OI的患者；(2)女方雙側(cè)卵巢形態(tài)正常，宮腔形態(tài)正常；(3)女方卵巢儲(chǔ)備功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)遺傳方式為常染色體隱性遺傳或伴X染色體遺傳的OI患者；(2)夫妻雙方患有其他單基因遺傳?。?3)女方存在泌尿生殖器畸形；(4)女方存在內(nèi)分泌或代謝異常(垂體，腎上腺、胰腺、肝臟或腎臟)。共有3對(duì)夫妻自愿申請(qǐng)采用PGT-M技術(shù)指導(dǎo)生育，夫妻雙方外周血基因組DNA(gDNA)經(jīng)傳統(tǒng)的一代測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中一方攜帶導(dǎo)致OI的COL1A1基因致病突變。南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究方案的實(shí)施(批件編號(hào)2012002)，患者均已簽署知情同意書。

家系Ⅰ：女方懷孕至7個(gè)月時(shí)，因胎兒骨骼系統(tǒng)發(fā)育異常行引產(chǎn)術(shù)，對(duì)流產(chǎn)胎兒皮膚樣品進(jìn)行基因檢測(cè)和染色體微陣列分析(Chromosomal microarray analysis，CMA)，CMA未見(jiàn)異常，胎兒COL1A1 Exon31：c.2089C>T，p.Arg697*雜合無(wú)義突變。女方被證實(shí)攜帶同樣突變，且雙耳先天性聽小骨硬化，藍(lán)色鞏膜?；颊呓邮苓z傳咨詢后，于2020年5月來(lái)本中心接受輔助生殖助孕。本家系依據(jù)引產(chǎn)胎兒即先證者和夫妻雙方的遺傳信息構(gòu)建SNP單體型。

家系Ⅱ：男方具有OI家族史，COL1A1 Exon21：c.1438del，p.Leu480Cysfs*61雜合移碼突變，一直避孕中。夫妻雙方接受遺傳咨詢后，于2020年6月來(lái)本中心接受輔助生殖助孕。本家系依據(jù)男方父母以及夫妻雙方的遺傳信息構(gòu)建SNP單體型。

家系Ⅲ：夫妻雙方結(jié)婚3年后，于2015年自然受孕，孕至6個(gè)月時(shí)，因胎兒畸形行引產(chǎn)。男方小時(shí)候經(jīng)常骨折，體格檢查顯示其具有OI的典型特征，包括脊柱側(cè)凸和身材矮小。遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示男方為COL1A1 Exon33：c.2299G>A，p.Gly767Ser雜合錯(cuò)義突變，女方基因型正常，于2016年8月在本中心接受輔助生殖助孕。男方父母COL1A1基因未檢測(cè)到致病突變，且引產(chǎn)胎兒的樣本未保留，因此本家系分離男方的單精子，篩選突變精子和野生型精子，結(jié)合夫妻雙方的遺傳信息構(gòu)建SNP單體型。

二、研究方法

1.體外受精、胚胎培養(yǎng)和囊胚活檢：成熟卵母細(xì)胞行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)，注射后16～18 h進(jìn)行原核觀察。胚胎采用序貫培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)(G1/G2，Vitrolife，瑞典)，培養(yǎng)溫度為37℃，氣體濃度為5%O2、6%CO2和89%N2。ICSI注射后第3天，用激光在卵裂期胚胎的透明帶打10 μm孔徑，再將胚胎置換到G2培養(yǎng)液中進(jìn)行囊胚培養(yǎng)。由兩位高年資胚胎學(xué)家依據(jù)Gardner囊胚評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[14-15]對(duì)D5和D6囊胚進(jìn)行評(píng)估，用內(nèi)徑為20 μm活檢針從囊胚滋養(yǎng)層中吸取大約5～10個(gè)細(xì)胞后，使用激光輔助切割，得到的細(xì)胞用PBS洗滌3次后，轉(zhuǎn)移至0.2 ml PCR管，-80℃冰箱儲(chǔ)存。

2.全基因組擴(kuò)增和基于二代測(cè)序的SNP單體型分析：活檢得到的滋養(yǎng)層細(xì)胞用REPLI-g單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒(Qiagen，德國(guó))進(jìn)行多重置換擴(kuò)增(Multiple displacement amplification，MDA)以得到全基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，采用DNA高通量測(cè)序技術(shù)，鑒別三組家系的COL1A1基因(NM_000088.3 chr17：48261457-48279003)臨近區(qū)域特異性SNP位點(diǎn)。在基因上下游1 M內(nèi)各篩選50個(gè)高頻有效的SNP位點(diǎn)，1 M外各篩選10個(gè)有效SNP位點(diǎn)，建立單體型，再結(jié)合家系基因型結(jié)果，解析與基因型連鎖的單體型遺傳關(guān)系。胚胎同時(shí)進(jìn)行基于NGS的SNP單體型分析和針對(duì)突變位點(diǎn)的一代測(cè)序檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)胚胎基因型的診斷。家系Ⅰ單體型分析時(shí)，選擇120個(gè)SNP位點(diǎn)和致病突變位點(diǎn)(COL1A1 Exon31：c.2089C>T)對(duì)患者夫妻雙方及其因骨骼發(fā)育異常行引產(chǎn)的胎兒gDNA 進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)，從中篩選10個(gè)有效SNPs構(gòu)建了單體型。家系Ⅱ選擇120個(gè)SNP位點(diǎn)和致病突變位點(diǎn)(COL1A1 Exon21：c.1438del)對(duì)夫妻雙方以及男方父母的gDNA進(jìn)行高通量測(cè)序，從中篩選10個(gè)有效SNPs構(gòu)建了單體型。家系Ⅲ分離單精子，一代測(cè)序檢測(cè)單精子是否攜帶COL1A1 Exon33：c.2299G>A突變，篩選出突變精子和野生精子；單體型分析時(shí)，選擇93個(gè)SNP位點(diǎn)和致病突變位點(diǎn)對(duì)突變精子、野生精子的WGA產(chǎn)物以及夫妻雙方外周血gDNA進(jìn)行高通量測(cè)序，從中篩選10個(gè)有效SNPs構(gòu)建了單體型。

3.凍融胚胎移植與隨訪：根據(jù)PGT-M的結(jié)果，將基因型正常且染色體拷貝數(shù)正常的囊胚移入患者子宮。移植后14 d，檢測(cè)女方血清中HCG水平。移植后6周，經(jīng)B超檢測(cè)孕囊和胎心判斷臨床妊娠。孕18～21周時(shí)，羊水穿刺進(jìn)行胎兒基因型診斷，進(jìn)一步確定為非突變基因型。

結(jié) 果

一、胚胎培養(yǎng)結(jié)果

家系Ⅰ共獲卵16枚，其中MⅡ卵母細(xì)胞11枚行ICSI注射。授精后16～18 h觀察，2PN受精卵8枚。授精后第3天，8細(xì)胞胚胎3枚，7細(xì)胞胚胎1枚，12細(xì)胞胚胎2枚，2細(xì)胞發(fā)育停滯胚胎1枚，1細(xì)胞發(fā)育停滯胚胎1枚，共6枚胚胎行囊胚培養(yǎng)。授精后第5天3枚胚胎發(fā)育為可活檢囊胚(編號(hào)為1-B6、1-B8、1-B9)，第6天有1枚胚胎發(fā)育為可活檢囊胚(編號(hào)為1-B11)，共4枚囊胚行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。每個(gè)移植周期僅移植一枚基因型正常的整倍體囊胚(表1)。

家系Ⅱ獲卵18枚，其中MⅡ卵母細(xì)胞 12枚行ICSI注射。授精后16～18 h觀察，2PN受精卵8枚，1PN受精卵1枚。授精后第3天，8細(xì)胞胚胎1枚，12細(xì)胞胚胎1枚，7細(xì)胞胚胎1枚，6細(xì)胞胚胎2枚，4細(xì)胞胚胎2枚，3細(xì)胞發(fā)育停滯胚胎1枚，1細(xì)胞發(fā)育停滯胚胎1枚，共7枚胚胎行囊胚培養(yǎng)。授精后第5天2枚胚胎發(fā)育為可活檢囊胚(編號(hào)為2-B1和2-B10)，第6天1枚胚胎發(fā)育為可活檢囊胚(編號(hào)為2-B3)，共3枚囊胚行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。每個(gè)移植周期僅移植一枚基因型正常的整倍體囊胚(表1)。

家系Ⅲ獲卵18枚，其中成熟卵母細(xì)胞12枚行ICSI注射。授精后16～18 h觀察，2PN受精卵9枚，1PN受精卵1枚。授精后第3天，8細(xì)胞胚胎7枚，9細(xì)胞胚胎2枚，7細(xì)胞胚胎1枚，共10枚胚胎行囊胚培養(yǎng)。授精后第5天2枚胚胎發(fā)育為可活檢囊胚(編號(hào)為3-B3和3-B12)，第6天1枚胚胎發(fā)育為可活檢囊胚(編號(hào)為3-B11)，共3枚囊胚行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。每個(gè)移植周期僅移植一枚基因型正常的整倍體囊胚(表1)。

表1 各家系促排移植情況(n)

二、OI遺傳學(xué)診斷結(jié)果

3個(gè)家系共活檢了10枚囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞，均通過(guò)MDA擴(kuò)增方法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和高通量測(cè)序，并依據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果構(gòu)建了SNP單體型。

家系Ⅰ單體型分析結(jié)果顯示，囊胚1-B6、1-B9和1-B11遺傳了母系攜帶突變基因的染色體為感染OI胚胎，囊胚1-B8遺傳母系未有突變位點(diǎn)的染色體為基因型正常囊胚(圖1A)。家系Ⅱ的單體型分析結(jié)果顯示，囊胚2-B1為感染OI囊胚，2-B3和2-B10則為基因型正常囊胚(圖1B)。家系Ⅲ的單體型分析結(jié)果顯示，囊胚3-B3和3-B12來(lái)源于父系的單體型與野生型精子一致，則為基因型正常囊胚；囊胚3-B11來(lái)源于父系的單體型與突變精子的單體型一致，為感染OI囊胚(圖1C)。10枚囊胚一代測(cè)序檢測(cè)的結(jié)果與單體型分析結(jié)果相吻合。

A：家系Ⅰ；B：家系Ⅱ；C：家系Ⅲ；紅色標(biāo)注堿基為突變位點(diǎn)，灰色鏈代表致病染色體，黑色標(biāo)識(shí)代表OI患者

三、臨床隨訪結(jié)果

家系Ⅰ移植囊胚1-B8后14 d，檢測(cè)女方血清β-HCG值為1 494 U/L，移植后42 d，B超檢查見(jiàn)到有心跳的孕囊。患者拒絕行羊膜腔穿刺，但在妊娠期間所有B超檢查均顯示胎兒無(wú)骨骼或其他臟器異常。在妊娠37周時(shí)，剖腹產(chǎn)一名3 500 g健康男嬰，無(wú)出生缺陷。

家系Ⅱ活檢3枚囊胚，檢測(cè)結(jié)果顯示囊胚2-B3和2-B10基因型正常，但2-B10染色體拷貝數(shù)異常，11號(hào)染色體為三倍體。患者移植囊胚2-B3后14 d，檢測(cè)女方血清β-HCG值為0.35 U/L，未妊娠。

家系Ⅲ移植囊胚3-B12后14 d，檢測(cè)女方血清β-HCG值為1 304 U/L，移植后42 d，B超檢查見(jiàn)到有心跳的孕囊?；颊咴谠?9周時(shí)行羊膜腔穿刺術(shù)，培養(yǎng)的羊水細(xì)胞提取gDNA未檢測(cè)到COL1A1 Exon33：c.2299G>A致病突變。在妊娠40周，患者剖腹產(chǎn)一名體重為4 250 g健康女嬰，無(wú)出生缺陷。

討 論

OI又被稱為脆性骨病，是一種罕見(jiàn)的遺傳性結(jié)締組織、骨骼系統(tǒng)疾病，其臨床表現(xiàn)類型多樣，會(huì)嚴(yán)重影響患者的生存和生活質(zhì)量，目前尚無(wú)有效的治療方法[16]。因此，建立PGT-M及產(chǎn)前診斷OI的技術(shù)平臺(tái)，預(yù)防OI發(fā)生和阻斷OI的遺傳缺陷的垂直傳遞，具有十分重要的意義。本研究中的三例OI均由COL1A1基因的雜合突變導(dǎo)致。COL1A1基因位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂17q21.3，編碼I型膠原蛋白α1鏈，該蛋白存在于大多數(shù)結(jié)締組織中，在骨骼、鞏膜、真皮和肌腱中含量豐富，當(dāng)結(jié)構(gòu)、含量異?；蚍g后修飾及折疊錯(cuò)誤等會(huì)導(dǎo)致OI[17]。

由于COL1A1突變導(dǎo)致的OI為常染色體顯性遺傳病，而在PGT-M診斷中，對(duì)于基因顯性遺傳病的檢測(cè)，直接檢測(cè)法中出現(xiàn)的ADO會(huì)導(dǎo)致攜帶雜合致病基因的胚胎被用于移植，而PGT-M的誤診會(huì)給患者生理和心理造成巨大創(chuàng)傷。因此，本研究將一代測(cè)序檢測(cè)致病位點(diǎn)聯(lián)合基于NGS的SNP單體型分析技術(shù)，應(yīng)用于顯性遺傳病的PGT-M檢測(cè)，有效避免了ADO引起的誤診，從而在OI家系中阻斷了致病基因的垂直傳遞?！陡咄炕驕y(cè)序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷和篩查技術(shù)規(guī)范(試行)》規(guī)定：對(duì)基因型疾病的PGT檢測(cè)，需要再進(jìn)行靶基因上下游緊密連鎖的SNP位點(diǎn)或短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)的分析，以通過(guò)多種檢測(cè)手段相互印證結(jié)果，從而確保準(zhǔn)確性、降低誤診率[18]。本研究的單體型分析沒(méi)有使用STR作為多態(tài)位點(diǎn)，而是采用在基因組中數(shù)量更多、分布更廣的SNP位點(diǎn)構(gòu)建單體型。并且，為了避免受到同源重組的影響，本研究是在COL1A1基因上下游2M內(nèi)篩選有效的SNP位點(diǎn)。

單體型分析為一種間接的檢測(cè)方法，需要有基因型和遺傳關(guān)系明確的家系樣本，若家系中沒(méi)有其他親屬致病，患者為新發(fā)突變，則可用患者的配子作為連鎖分析的依據(jù)[12-13]，也能夠從胚胎中尋找先證者。本研究中家系Ⅰ女方為COL1A1基因新發(fā)突變，但未出現(xiàn)易骨折等異常表現(xiàn)，其父母基因型正常，則以引產(chǎn)的骨骼發(fā)育異常的胎兒為先證者，依據(jù)先證者及患者夫婦的遺傳信息，成功構(gòu)建了SNP單體型。家系Ⅱ具有OI的家族遺傳，男方父親即為OI患者，依據(jù)患者夫妻雙方及男方父母的遺傳信息，構(gòu)建SNP單體型。家系Ⅲ中的男方為OI患者，其父母基因型正常，家系中無(wú)其他OI患者，雖曾孕畸形胎兒，但未做基因型檢測(cè)，也沒(méi)有保留引產(chǎn)胎兒的遺傳物質(zhì)，故通過(guò)分離該患者的單精子，進(jìn)行單精子全基因組擴(kuò)增后，PCR擴(kuò)增一代測(cè)序檢測(cè)突變位點(diǎn)，區(qū)分野生型精子和突變精子，再通過(guò)NGS對(duì)野生型單精子和突變單精子及患者夫婦COL1A1基因組及臨近區(qū)域特異性SNP位點(diǎn)進(jìn)行鑒別，從而構(gòu)建單體型區(qū)分致病基因所在的染色體和正常染色體。對(duì)于新發(fā)突變的單基因病患者，還可以從活檢的胚胎中尋找先證者，先通過(guò)一代測(cè)序檢測(cè)基因型，再通過(guò)NGS鑒別致病基因及其臨近區(qū)域的特異性SNP位點(diǎn)構(gòu)建單體型后，反向印證一代測(cè)序的結(jié)果。因明確遺傳信息的患者家系樣本或新發(fā)突變患者的配子、胚胎均可通過(guò)NGS鑒別致病基因及其鄰近區(qū)域的高頻突變SNP位點(diǎn)用于構(gòu)建單體型，從而使SNP單體型分析技術(shù)具有普遍適用性。

總之，基于NGS的SNP單體型分析結(jié)合致病基因的一代測(cè)序，來(lái)進(jìn)行OI的胚胎植入前遺傳學(xué)，可以提高基因診斷的準(zhǔn)確性，有效消除誤診率。并且，不同SNP單體型的分析策略能使多種類型的單基因遺傳病患者從精準(zhǔn)醫(yī)療中獲益。本研究極大的豐富了PGT-M的臨床診斷策略。