李益豪, 趙 宇, 許磊川, 蘇彥豪, 張 倩, 王明安

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)系 農(nóng)藥創(chuàng)新研究中心，北京 100193)

螺環(huán)丁烯內(nèi)酯類化合物廣泛存在于自然界中，如spirofragilide[1]、lambertellol A[2]、crossalactone D[3]和pyrenolide D[3]等，這些天然產(chǎn)物具有殺蟲(chóng)[4]、殺菌[5]、抑制孢子萌發(fā)[6]、抗炎[7]和抗腫瘤[8]等多種優(yōu)良的生物活性，已商品化的螺環(huán)丁烯內(nèi)酯類農(nóng)藥品種包括螺螨酯 (spirodiclofen)、螺甲螨酯(spiromesifen)、螺蟲(chóng)乙酯 (spirotetramat) 和甲氧哌啶乙酯 (spiropidion)[9-12]，如圖式1 所示，可見(jiàn)螺環(huán)丁烯內(nèi)酯是一個(gè)值得深入研究的優(yōu)異藥效團(tuán)。

咪唑啉酮類化合物具有優(yōu)良的殺菌活性[13-17]，如已經(jīng)商品化的農(nóng)用殺菌劑咪唑菌酮 (fenamidone)是一種線粒體呼吸抑制劑，通過(guò)抑制病原菌線粒體呼吸作用進(jìn)而抑制能量的生成而達(dá)到殺菌作用，其作用機(jī)制獨(dú)特，殺菌譜廣，對(duì)葡萄及蔬菜霜霉病、馬鈴薯及番茄晚疫病等卵菌病害菌株有效[18]。在對(duì)咪唑菌酮的結(jié)構(gòu)改造過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)咪唑啉酮3-位被芐基取代時(shí)，也表現(xiàn)出優(yōu)異的殺菌活性[19-21]。本課題組前期采用多樣性導(dǎo)向合成的方法，以活性亞結(jié)構(gòu)拼接的原理將螺環(huán)丁烯內(nèi)酯和咪唑啉酮等多種藥效團(tuán)進(jìn)行組合，設(shè)計(jì)合成了包括5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-氨基咪唑啉-4-酮在內(nèi)的多類化合物，生物活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，部分化合物顯示出優(yōu)異的殺菌和殺蟲(chóng)活性[22-30]，但是發(fā)現(xiàn)這類2-氨基咪唑啉酮類化合物在溶液中存在多種互變異構(gòu)體，不便于表征其化學(xué)結(jié)構(gòu)和探討其構(gòu)效關(guān)系[22-24]。為了發(fā)現(xiàn)更高殺菌活性的該類化合物并減少互變異構(gòu)的可能，本文在前期工作的基礎(chǔ)上，參考3-芐基咪唑菌酮的結(jié)構(gòu)，期望在咪唑啉酮環(huán)的3-位引入芐基，設(shè)計(jì)合成一系列新型3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-氨基咪唑啉-4-酮類化合物 (設(shè)計(jì)策略見(jiàn)圖式2)，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征并評(píng)價(jià)其殺菌活性。合成路線見(jiàn)圖式3。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和藥劑

Bruker DPX 300 和Ascend 500 MHz 核磁共振儀 (以CDCl3為溶劑，TMS 為內(nèi)標(biāo))；WRX-4 顯微熔點(diǎn)儀 (上海易測(cè)儀器設(shè)備有限公司，溫度未校正)；島津高效液相色譜LC-20AT, Luna C18反相色譜柱 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm, Phenomenex,Torrance, CA, USA)，流動(dòng)相為甲醇/水 (V甲醇:V水=60 : 40)，流速1.0 mL/min, 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。SHB-III 循環(huán)式真空泵 (鄭州恒巖儀器有限公司)；EYELA N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (北京天林恒泰科技有限公司)；DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

柱層析硅膠為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)(200～300 目)；試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純，無(wú)水溶劑用常規(guī)方法干燥處理；98%多菌靈 (carbendazim) 原藥，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；98%咪唑菌酮 (fenamidone) 原藥，拜耳作物科學(xué)公司。

1.2 目標(biāo)化合物的合成

1.2.1 3-乙酰基-4-甲基-1-氧螺[4,5]癸-3-烯-2-酮(2) 的合成 參照前文方法合成，得到白色固體，收率53%，m. p. 98～99 ℃，其1H NMR 和熔點(diǎn)數(shù)據(jù)與前文[23]一致。

1.2.2 3-芐基-2-硫代乙內(nèi)酰脲 (3) 的合成 參照文獻(xiàn)方法[31]合成，得到黃色固體，收率91%，m. p.191～193 ℃，其1H NMR 和熔點(diǎn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]一致。

1.2.3 化合物4 和5 的合成 在100 mL 圓底瓶中，依次加入1.50 g (7.2 mmol) 化合物2、1.48 g(7.2 mmol) 化合物3、40 mL 甲苯和1 mL 三乙胺，緩慢加入0.66 g (10.8 mmol) 乙醇胺，110 ℃回流攪拌反應(yīng)6 h。薄層層析 (展開(kāi)劑為V正己烷:V乙酸乙酯=5 : 1) 監(jiān)測(cè)至原料點(diǎn)消失。將反應(yīng)液冷卻至室溫后減壓旋蒸除去甲苯，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析 (V正己烷:V乙酸乙酯= 8 : 1) 分離，得到202 mg 淡黃色固體化合物4 和1.53 g 淡黃色固體化合物5。

(Z)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-硫代-2,4-咪唑二酮 (4)：淡黃色固體，收率7%，m.p. 157～159 ℃.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ:8.75 (s, 1H), 7.50 (d,J= 5.0 Hz, 2H), 7.35-7.27 (m, 3H), 5.05(s, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.80-1.25 (m, 10H);13C NMR (75 MHz, CDCl3),δ: 176.57, 170.73, 170.27, 162.69,135.68, 129.10, 128.66, 128.08, 126.82, 125.39, 118.75, 89.15,44.75, 33.66, 24.50, 21.93, 16.81, 13.29. HR-ESI-MS:C22H25N2O3S [M+H]+，計(jì)算值397.158 0，測(cè)試值397.158 4.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-硫代-2,4-咪唑二酮 (5)：淡黃色固體，收率53%，m.p. 179～181 ℃.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ:9.66 (s, 1H), 7.39 (d,J= 5.0 Hz, 2H), 7.32-7.20 (m, 3H), 4.99(s, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.83-1.20 (m, 10H).13C NMR (75 MHz, CDCl3),δ: 176.95, 170.78, 169.28, 160.55,135.55, 128.65, 128.58, 127.93, 127.71, 123.37, 118.13, 88.60,44.49, 33.61, 33.23, 24.75, 22.02, 18.89, 12.91. HR-ESI-MS:C22H25N2O3S [M+H]+，計(jì)算值397.158 0，測(cè)試值397.158 6.

1.2.4 化合物6 和7 的合成及構(gòu)型轉(zhuǎn)化 在50 mL圓底瓶中，加入200 mg (0.5 mmol) 化合物4、104 mg(0.75 mmol) 碳酸鉀和20 mL 乙腈，攪拌下緩慢滴加107 mg (0.75 mmol) 碘甲烷，室溫反應(yīng)6 h。薄層層析 (展開(kāi)劑為V石油醚:V乙酸乙酯= 4 : 1) 監(jiān)測(cè)至原料點(diǎn)消失。過(guò)濾除去碳酸鉀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈，用乙酸乙酯重結(jié)晶得到188 mg 黃色固體化合物6。以5 為原料，采用相同的方法合成化合物7。

(Z)-3-芐基-2-甲硫基-5-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]-癸-3-烯-3-亞乙基)-咪唑啉-4-酮 (6)：黃色固體, 188 mg，收率91%，m.p. 171～173 ℃.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ:7.35-7.27 (m, 5H), 4.71 (s, 2H), 2.57 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 1.87(s, 3H), 1.86-1.25 (m, 10H);13C NMR (75 MHz, CDCl3),δ:170.72, 168.41, 168.03, 161.24, 138.15, 135.86, 133.22,128.79, 128.04, 126.06, 87.84, 44.20, 33.69, 24.79, 22.09,16.18, 13.76, 12.85. HR-ESI-MS: C23H27N2O3S [M+H]+，計(jì)算值411.173 7，測(cè)試值411.173 8.

(E)-3-芐基-2-甲硫基-5-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]-癸-3-烯-3-亞乙基)-咪唑啉-4-酮 (7)：黃色固體, 1 500 mg，收率92%，m.p. 193～194 ℃.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ:7.34-7.22 (m, 5H), 4.69 (s, 2H), 2.61 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 1.91(s, 3H), 1.85-1.20 (m, 10H);13C NMR (75 MHz, CDCl3),δ:170.82, 168.23, 166.09, 162.67, 139.60, 135.82, 131.41,128.75, 127.94, 127.70, 124.50, 88.14, 44.03, 33.76, 33.36,24.88, 22.12, 19.13, 12.91, 12.66. HR-ESI-MS: C23H27N2O3S[M+H]+，計(jì)算值411.173 7，測(cè)試值411.174 0.

化合物6 和7 的構(gòu)型轉(zhuǎn)化：將20 mgZ-構(gòu)型純度為95%的化合物6 加入到含有少量醋酸的甲苯溶液中，攪拌回流，每隔2 h 取少量反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，以色譜純甲醇溶解樣品，用高效液相色譜 (HPLC) 儀進(jìn)行Z/E-構(gòu)型比例變化的分析檢測(cè)。采用相同的方法對(duì)化合物7 的構(gòu)型轉(zhuǎn)化進(jìn)行分析。

1.2.5 目標(biāo)化合物8a～8f 和9a～9h 的合成 分別以化合物8a 和9a 的合成為例：在50 mL 圓底瓶中依次加入300 mg (0.73 mmol) 化合物7、102 mg(1.1 mmol) 苯胺、1.5 mL 冰醋酸和13.5 mL 甲苯，110 ℃回流攪拌反應(yīng)8～10 h，薄層層析 (展開(kāi)劑為V乙酸乙酯:V石油醚= 1 : 3) 監(jiān)測(cè)至原料點(diǎn)消失。冷卻至室溫后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析 (V乙酸乙酯:V石油醚=1 : 8～1 : 3) 梯度洗脫，得到100 mg 米黃色固體化合物8a，收率30%和127 mg 淡黃色固體化合物9a，收率38%。以200 mg 化合物6 為原料采用相同方法與苯胺進(jìn)行反應(yīng)，薄層層析 (展開(kāi)劑為V乙酸乙酯:V石油醚=1 : 3) 監(jiān)測(cè)所得產(chǎn)物與化合物8a 和9a 的極性相同，經(jīng)硅膠柱層析得到80 mg 米黃色固體化合物8a 和75 mg 淡黃色固體化合物9a，核磁共振氫譜進(jìn)一步證明為化合物8a 和9a。采用相同方法以7 為原料合成化合物8b～8f 和9b～9h。

(Z)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-苯基氨基-咪唑啉-4-酮 (8a)：黃色固體，收率30%，m.p. 193～194 ℃.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ:7.60-6.90 (m, 10H), 4.93, 4.92 (s, 2H), 2.60, 2.38 (s, 3H), 1.90,1.87 (s, 3H), 1.75-1.20 (m, 10H). HR-ESI-MS: C28H30N3O3[M+H]+，計(jì)算值456.228 2，測(cè)試值456.228 5.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-苯基氨基-咪唑啉-4-酮 (9a)：淡黃色固體，收率38%，m.p. 190～191 ℃.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ:7.61-6.96 (m, 10H), 6.46 (s, 1H), 4.96-4.70 (m, 2H), 2.22 (s,1H), 1.93-1.20 (m, 15H). HR-ESI-MS: C28H30N3O3[M+H]+，計(jì)算值456.228 2，測(cè)試值456.228 0.

(Z)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(3-氟苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (8b)：淡黃色固體，收率23%，m.p. 182～184 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.74-7.01 (m, 7H), 6.84-6.51 (m, 3H), 4.90 (s, 2H),2.58, 2.37 (s, 3H), 1.93, 1.87 (s, 3H), 1.85-1.22 (m, 10H). HRESI-MS: C28H29FN3O3[M+H]+，計(jì)算值474.218 7，測(cè)試值474.218 3.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(3-氟苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (9b)：白色固體，收率44%，m.p. 221～223 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.75-6.60 (m, 9H), 6.46 (s, 1H), 4.98-4.67 (m, 2H),2.16 (s, 1H), 1.90-1.21 (m, 15H). HR-ESI-MS: C28H29FN3O3[M+H]+，計(jì)算值474.218 7，測(cè)試值474.218 6.

(Z)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-甲氧基苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (8c)：紅色固體，收率10%，m.p. 169～171 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.59-7.28 (m, 6H), 7.04-6.57 (m, 4H), 4.90 (s, 2H),3.77, 3.74 (s, 3H), 2.57, 2.36 (s, 3H), 1.90 (s, 3H), 1.87-1.19 (m,10H). HR-ESI-MS: C29H32N3O4[M+H]+，計(jì)算值486.238 7，測(cè)試值486.238 2.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-甲氧基苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (9c)：淡黃色固體，收率58%，m.p. 185～187 ℃.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.52-6.52 (m, 9H), 6.46 (s, 1H), 4.90-4.74(m, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.28 (s, 1H), 2.00-1.20 (m, 15H). HRESI-MS: C29H32N3O4[M+H]+，計(jì)算值486.238 7，測(cè)試值486.238 5.

(Z)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-叔丁基苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (8d)：黃色固體，收率29%，m.p. 177～178 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.59-6.86 (m, 9H), 6.60(s, 1H), 4.91, 4.88 (s, 2H),2.58, 2.36 (s, 3H), 1.88, 1.86 (s, 3H), 1.82-1.30 (m, 10H), 1.29, 1.25(s, 9H). HR-ESI-MS: C32H38N3O3[M+H]+，計(jì)算值512.290 8，測(cè)試值512.290 4.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-叔丁基苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (9d)：白色固體，收率45%，m.p. 191～192 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.49-7.27 (m, 8H), 6.92 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.51 (s,1H), 4.93-4.72 (m, 2H), 2.27 (s, 1H), 1.95-1.45 (m, 15H), 1.33, 1.27(s, 9H). HR-ESI-MS: C32H38N3O3[M+H]+，計(jì)算值512.290 8，測(cè)試值512.290 3.

(Z)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-溴苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (8e)：紅色固體，收率24%，m.p. 198～199 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.54-7.15 (m, 7H), 6.85 (d,J= 8.6 Hz, 2H), 4.90 (s,2H), 2.59, 2.37 (s, 3H), 1.94, 1.82 (s, 3H), 1.81-1.24 (m, 10H).HR-ESI-MS: C28H29BrN3O3[M+H]+，計(jì)算值534.138 7，測(cè)試值534.139 6.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-溴苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (9e)：白色固體，收率48%，m.p. 209～211 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.58-7.28 (m, 8H), 6.86 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.43 (s,1H), 4.99-4.65 (m, 2H), 2.16 (s, 1H), 1.95-1.21 (m, 15H). HRESI-MS: C28H29BrN3O3[M+H]+，計(jì)算值534.138 7，測(cè)試值534.139 3.

(Z)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-甲基苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (8f)：淡黃色固體，收率29%，m.p. 192～194 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.56-6.84 (m, 9H), 4.91, 4.88 (s, 3H), 2.58, 2.36 (s,3H), 2.30, 2.25 (s, 3H), 1.89, 1.86 (s, 3H), 1.80-1.20 (m, 10H).HR-ESI-MS: C29H32N3O3[M+H]+，計(jì)算值470.243 8，測(cè)試值470.244 1.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-甲基苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (9f)：白色固體，收率46%，m.p. 168～169 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.50-7.02 (m, 8H), 6.87 (d,J= 8.1 Hz, 1H), 6.44 (s,1H), 4.94-4.70 (m, 2H), 2.34, 2.27 (s, 3H), 2.25 (s, 1H), 1.90,1.85 (s, 3H), 1.82-1.25 (m, 12H). HR-ESI-MS: C29H32N3O3[M+H]+，計(jì)算值470.243 8，測(cè)試值470.243 5.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-三氟甲基苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (9g)：紅色固體，收率82%，m.p. 218～219 ℃.1H NMR (300 MHz, CDCl3),δ: 7.75-7.04 (m, 9H), 6.44 (s, 1H), 5.02-4.67(m, 2H), 2.16 (s, 1H), 1.90-1.20 (m, 15H). HR-ESI-MS:C29H29F3N3O3[M+H]+，計(jì)算值524.215 6，測(cè)試值524.216 2.

(E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-氟苯基) 氨基-咪唑啉-4-酮 (9h)：紅色固體，收率80%，m.p. 188～190 ℃.1H NMR (300 MHz,CDCl3),δ: 7.60-6.87 (m, 9H), 6.39 (s, 1H), 4.99-4.60 (m, 2H),2.17 (s, 1H), 1.89-1.25 (m, 15H). HR-ESI-MS: C28H29FN3O3[M+H]+，計(jì)算值474.218 7，測(cè)試值474.218 2.

1.3 量子化學(xué)計(jì)算

在Gaussian View 程序中建立3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-苯基氨基咪唑啉-4-酮 (8a 和9a) 分子模型，將其保存為高斯輸入文件，將該文件直接上傳至Gaussian 09W 程序中，計(jì)算該化合物各互變異構(gòu)體的優(yōu)化結(jié)構(gòu)。采用量子化學(xué)的密度泛函理論 (DFT) B3LYP方法，在B3LYP/6-31G (d, p) 水平上進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到理論計(jì)算的全優(yōu)化構(gòu)型，并對(duì)優(yōu)化結(jié)果計(jì)算頻率，振動(dòng)分析表明所得優(yōu)化構(gòu)型均對(duì)應(yīng)勢(shì)能面上能量最小點(diǎn) (即無(wú)虛振動(dòng)頻率)，為穩(wěn)定構(gòu)型，計(jì)算收斂精度采取程序設(shè)定的缺省值。全部計(jì)算利用Gaussian 09W 軟件在微機(jī)上進(jìn)行。

1.4 殺菌活性測(cè)定

1.4.1 離體殺菌活性測(cè)試 供試菌株：棉花立枯絲核菌Rhizoctonia solani、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum和小麥赤霉病菌Fusarium graminearum，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理系分離并保存，活性測(cè)試時(shí)需要進(jìn)一步活化。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[32]測(cè)定。以DMSO 為溶劑，先將供試化合物配制成質(zhì)量濃度為5 000 mg/L的藥液，再以馬鈴薯葡萄糖瓊脂液體 (PDA) 培養(yǎng)基稀釋，制備成50 mg/L 的含藥PDA 平板供試。將菌餅接種于含藥PDA 培養(yǎng)基中央，置于24 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3 d，以十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。以多菌靈和咪唑菌酮為對(duì)照藥劑。以空白對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑和藥劑處理的菌落增長(zhǎng)直徑的差值與空白對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑的比值來(lái)計(jì)算各藥劑處理對(duì)各種病原菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率。EC50測(cè)定時(shí)，根據(jù)抑制率不同在100～0.1 mg/L 之間設(shè)置5 個(gè)濃度梯度。

1.4.2 活體殺菌活性測(cè)試 供試菌株：黃瓜霜霉病菌Pseudoperonospora cubensis、小麥白粉病菌Erysiphe graminis和玉米銹病菌Puccinia sorghiSchw.，由沈陽(yáng)化工研究院分離并保存。

采用活體盆栽法[33-34]測(cè)定。將待測(cè)樣品先用少量溶劑DMF 溶解，再用含有0.1%吐溫-80 的水稀釋，配制成質(zhì)量濃度為400 mg/L 的藥液。在小型噴霧塔上，將藥液噴施于病害寄主植物上 (寄主植物為在溫室內(nèi)培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)盆栽苗，新泰密刺黃瓜一葉一心期，遼春10 號(hào)小麥二葉期，金黃糯2 號(hào)玉米2～3 葉期)，24 h 后接種供試菌株，置于人工氣候室培養(yǎng)，待葉片被侵染后移入溫室繼續(xù)培養(yǎng)，大約7 d 后進(jìn)行防治效果評(píng)估。每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值，以氟醚菌胺和氰霜唑?yàn)閷?duì)照藥劑?；铙w活性測(cè)試由沈陽(yáng)中化化工有限公司新農(nóng)藥創(chuàng)制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室參照前文方法[33-34]協(xié)助完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成、雙鍵構(gòu)型及產(chǎn)物構(gòu)型的轉(zhuǎn)化

參照文獻(xiàn)方法，以環(huán)己酮和乙烯基乙醚為原料合成α-羥基酮 (1)，在堿性條件下1 再與雙乙烯酮反應(yīng)合成2；采用異硫氰酸芐酯和甘氨酸甲酯鹽酸鹽為原料制備3；化合物2 和3 通過(guò)縮合反應(yīng)分離得到具有Z-和E-構(gòu)型的化合物4 和5。實(shí)驗(yàn)室前期所合成的此類化合物均為E-構(gòu)型化合物[23-24]，本研究中，化合物5 的兩個(gè)特征甲基化學(xué)位移 (δ)在2.10 和1.87，與前文[15]中具有E-構(gòu)型的類似中間體δ2.02 和1.85 基本一致，可以確定化合物5 也具有E-構(gòu)型；而化合物4 的兩個(gè)特征甲基δ在低場(chǎng)的2.40 和2.00，由此確定化合物4 具有Z-構(gòu)型。本文首次分離得到Z-構(gòu)型的該類化合物。分別將4 和5 在堿性條件下用碘甲烷進(jìn)行甲基化得到化合物6 和7，該反應(yīng)不涉及雙鍵構(gòu)型的變化，因此6 和7 也分別具有Z-和E-構(gòu)型。它們?cè)诒姿岽呋屡c各種取代苯胺進(jìn)行衍生化反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物8a～8f 和9a～9h。值得注意的是，化合物7 分別與對(duì)氟甲基苯胺和對(duì)氟苯胺反應(yīng)后只分離到化合物9g 和9h。

有趣的是，在縮合反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行硅膠柱層析分離時(shí)，僅分離得到少量的Z-構(gòu)型產(chǎn)物4，說(shuō)明該反應(yīng)仍然以相對(duì)更加穩(wěn)定的E-構(gòu)型產(chǎn)物5 為主要產(chǎn)物。在堿性條件下，在用碘甲烷分別對(duì)4 和5 進(jìn)行甲基化制備化合物6 和7 時(shí)，產(chǎn)物雙鍵構(gòu)型保持不變；而在以化合物6 和7 為原料進(jìn)行衍生化反應(yīng)時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)均會(huì)得到不同比例的Z/E-構(gòu)型兩種產(chǎn)物，但仍然以E-構(gòu)型產(chǎn)物9 為主要產(chǎn)物。由于衍生化反應(yīng)以醋酸作為催化劑，推測(cè)E-或Z-構(gòu)型化合物在酸性條件下可以發(fā)生部分的構(gòu)型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的Z-或E-構(gòu)型化合物，達(dá)到動(dòng)力學(xué)平衡狀態(tài)。為了證明這一推測(cè)的合理性，用HPLC 方法對(duì)中間體6 和7 在酸性條件下Z/E-構(gòu)型比例的變化進(jìn)行了分析檢測(cè)，結(jié)果如圖1 所示。HPLC 的分析結(jié)果證明，在酸性條件下Z-構(gòu)型產(chǎn)物6 會(huì)轉(zhuǎn)化為E-構(gòu)型產(chǎn)物7，E-構(gòu)型產(chǎn)物7 也會(huì)轉(zhuǎn)化為Z-構(gòu)型產(chǎn)物6，但大約6 h 后在反應(yīng)平衡時(shí)總是以能量上更穩(wěn)定的E-構(gòu)型產(chǎn)物7 為主要存在形式，所以最終生成E-構(gòu)型產(chǎn)物9 為主要產(chǎn)物。

經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)存在類似的情況[35]，推斷構(gòu)型轉(zhuǎn)化原因可能是E-構(gòu)型化合物6 的咪唑啉酮1-位氮原子在酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化，導(dǎo)致咪唑啉酮開(kāi)環(huán)，發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化后，再關(guān)環(huán)成E-構(gòu)型化合物7，見(jiàn)圖式4 所示。這種構(gòu)型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象在沒(méi)有3-芐基的同類反應(yīng)中并不明顯。

2.2 化合物的氫譜解析和互變異構(gòu)分析

目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR 和高分辨質(zhì)譜進(jìn)行了表征。通過(guò)咪唑啉酮3-位芐基的引入，希望減少互變異構(gòu)的可能性，實(shí)際上通過(guò)Z-構(gòu)型6 或E-構(gòu)型7 衍生化所得到的產(chǎn)物8a～8f 和9a～9h，可以通過(guò)柱層析進(jìn)行有效的分離，但是8a～8f 和9a～9h 在溶液中仍然存在互變異構(gòu)體。δ在4.0～5.0 之間的亞甲基質(zhì)子和δ在2.0～3.0 范圍的一個(gè)甲基質(zhì)子是最特征的1H NMR 譜線，易于識(shí)別，可用于互變異構(gòu)體的相對(duì)量分析，而其余質(zhì)子在低場(chǎng)的芳環(huán)區(qū)以及高場(chǎng)的飽和碳上質(zhì)子區(qū)相互重疊，難以區(qū)分。分離得到的Z-構(gòu)型產(chǎn)物8 為兩種互變異構(gòu)體的混合物，n(8-1) :n(8-2) 在1.0 : 2.5～1.0 : 4.0 之間，兩種互變異構(gòu)體芐基的亞甲基部分都為單峰并基本重疊在一起，說(shuō)明這兩個(gè)異構(gòu)體的兩個(gè)亞甲基質(zhì)子為等價(jià)質(zhì)子 (圖2)。在圖式5 所示的8a-1 和8a-2 兩種結(jié)構(gòu)中，3-芐基所在的C—N 單鍵可以自由旋轉(zhuǎn)，使兩個(gè)亞甲基質(zhì)子成為等價(jià)質(zhì)子呈現(xiàn)單峰與實(shí)際譜圖一致，因此化合物8a 在溶液中主要為8a-1 和8a-2 所示的兩種異構(gòu)體所處的動(dòng)力學(xué)平衡中，在化學(xué)位移相對(duì)高場(chǎng)的一個(gè)甲基呈現(xiàn)出n(8a-1) :n(8a-2) 為1.0 :2.5 的比例；與之類似，化合物8b 和8e 兩種異構(gòu)體的比例為1.0 : 2.5 和1.0 : 4.0 (圖2)；所分離得到的E-構(gòu)型產(chǎn)物9 也為兩種互變異構(gòu)體的混合物，比例都在1.0 : 1.6～1.0 : 2.0，芐基的亞甲基部分為一個(gè)單峰和一個(gè)J= 16.5 Hz 左右的AB 四重峰 (圖2)，說(shuō)明其中一個(gè)異構(gòu)體9a-1 的兩個(gè)亞甲基質(zhì)子為等價(jià)質(zhì)子，而另一個(gè)異構(gòu)體9a-2 的兩個(gè)亞甲基質(zhì)子為不等價(jià)質(zhì)子。類似Z-構(gòu)型產(chǎn)物8 的分析和前文[23-24]有關(guān)E-構(gòu)型產(chǎn)物的晶體X-射線衍射分析結(jié)果，推斷異構(gòu)體9a-2 的C=N 雙鍵位于咪唑啉酮環(huán)外，由于空間位阻導(dǎo)致芐基所在的CN 單鍵旋轉(zhuǎn)受阻，從而使芐基亞甲基上的兩個(gè)質(zhì)子不等價(jià)形成一個(gè)偶合常數(shù)較大的AB 系統(tǒng)，通過(guò)9a-1 的亞甲基單峰和9a-2 的AB 四重峰積分面積得到比例n(9a-1) :n(9a-2) 在1.0 : 1.6 左右；與之類似，化合物9b 和9e 兩種異構(gòu)體的比例均為1 : 2 (圖2)。為了進(jìn)一步證實(shí)上述推測(cè)的結(jié)論，對(duì)8a 的兩種互變異構(gòu)體8a-1 和8a-2，以及9a 的兩種互變異構(gòu)體9a-1 和9a-2 進(jìn)行了量子化學(xué)計(jì)算。結(jié)果 (表1) 表明，異構(gòu)體8a-1 和8a-2 能量非常接近，它們的能量差只有0.26 kJ/mol，9a-1 和9a-2 的能量差也只有2.04 kJ/mol，這一結(jié)果也說(shuō)明了無(wú)論是中間體6 或7 反應(yīng)后均可以得到8a～8f 和9a～9h 兩類產(chǎn)物，且8a～8f 和9a～9h 兩類產(chǎn)物在溶液中均以兩種互變異構(gòu)體形式存在的原因。由于兩種互變異構(gòu)體的含量接近，通過(guò)不同溶劑重結(jié)晶來(lái)獲取8a～8f 和9a～9h 的單晶，以了解在固體中8a～8f 和9a～9h 的結(jié)構(gòu)存在形式的嘗試未能獲得成功。

表1 化合物8a 和9a 互變異構(gòu)體的量子化學(xué)計(jì)算結(jié)果Table 1 Quantum calculation results of compounds 8a and 9a tautomerism isomers

2.3 殺菌活性

2.3.1 離體殺菌活性 測(cè)試結(jié)果 (表2) 表明：在50 mg/L 下，具有E-構(gòu)型的中間體5 和7 對(duì)5 種供試植物病原菌的抑制活性均好于Z-構(gòu)型的中間體4 和6；具有E-構(gòu)型的目標(biāo)化合物9c、9d、9f和9h 對(duì)油菜菌核病菌的抑制活性也好于Z-構(gòu)型的化合物8c、8d、8f 和8h。表明該類E-構(gòu)型化合物的抑菌活性明顯好于Z-構(gòu)型化合物，說(shuō)明5 位雙鍵的構(gòu)型對(duì)該類化合物的離體抑菌活性有顯著影響。

表2 目標(biāo)化合物的離體殺菌活性 (抑制率/%, 50 mg/L)Table 2 The in vitro fungicidal activities of target compounds (inhibition rate/%, 50 mg/L)

化合物9c、9d 和9h 對(duì)油菜菌核病菌具有顯著的抑制效果，在50 mg/L 下抑制率大于70%，抑制效果優(yōu)于對(duì)照藥劑咪唑菌酮，其余化合物對(duì)供試病原菌的抑制效果相對(duì)較差。毒力測(cè)試結(jié)果(表3) 顯示，化合物9c、9d 和9h 對(duì)油菜菌核病菌的EC50值分別為14.3、21.8 和21.1 mg/L，顯著優(yōu)于對(duì)照藥劑咪唑菌酮 (EC50= 46.8 mg/L)。分析該類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和殺菌活性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2 位苯胺上的取代基為4-OCH3、4-C(CH3)3和4-F時(shí)，對(duì)油菜菌核病菌的抑制效果較好，而4 位的CH3、Br、CF3和3 位的F 取代均導(dǎo)致抑菌活性顯著降低。與本課題組前期所合成的3-位無(wú)芐基取代的2-氨基咪唑啉-4-酮系列化合物相比[23]，在相同質(zhì)量濃度下，9c、9f 和9h 對(duì)油菜菌核病菌的抑制率為88.0%、69.5%和84.1%，比相應(yīng)的3-位無(wú)芐基取代的3 個(gè)化合物的抑制率 (46.8%、21.2%和49.9%) 有了明顯提高[23]，證明芐基的引入確實(shí)可以提高該類化合物的抑菌活性。

表3 部分化合物對(duì)油菜菌核病菌的EC50 值Table 3 EC50 values of some compounds against S. sclerotiorum

2.3.2 活體殺菌活性 測(cè)試結(jié)果 (表4) 表明：在400 mg/L 劑量下，中間體化合物4 和5 對(duì)于黃瓜霜霉病、小麥白粉病和玉米銹病均沒(méi)有明顯的防治效果，而硫酮甲基化后所得到的化合物6 和7 對(duì)黃瓜霜霉病顯示一定的防治效果。用取代苯胺對(duì)中間體6 和7 進(jìn)一步衍生化后的目標(biāo)化合物，大部分對(duì)黃瓜霜霉病都表現(xiàn)出較好的防治效果，其中化合物8a、9c 的防治效果最好，均達(dá)到了80%，化合物9c 和8d 對(duì)于小麥白粉病也有較好的防治效果，防效分別為85%和80%，只有化合物9f 對(duì)玉米銹病顯示出40%的防效。分析活體生測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)無(wú)取代和對(duì)位為給電子基團(tuán) (如t-C4H9、-OCH3) 取代苯胺時(shí)的化合物對(duì)黃瓜霜霉病具有一定的防治效果，而吸電子取代基或?qū)ξ惠^弱給電子取代基存在時(shí)，化合物的防效明顯下降。

表4 目標(biāo)化合物的活體殺菌活性 (400 mg/L)Table 4 The in vivo fungicidal activity of target compounds (400 mg/L)

離體和活體殺菌結(jié)果表明，采用對(duì)叔丁基苯胺和對(duì)甲氧基苯胺進(jìn)行衍生化所得到的目標(biāo)化合物活性最好，特別是 (E)-3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-(4-甲氧基苯基) 氨基咪唑啉-4-酮 (9c) 對(duì)于油菜菌核病菌、黃瓜霜霉病和小麥白粉病都具有較好的抑制效果，是值得進(jìn)一步優(yōu)化的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。與離體抑菌活性不同，5 位雙鍵的構(gòu)型對(duì)該類化合物的活體殺菌活性沒(méi)有顯著影響，可能與多種環(huán)境因素有關(guān)，其具體原因尚待進(jìn)一步探討。

3 結(jié)論

采用活性亞結(jié)構(gòu)拼接原理將螺環(huán)丁烯內(nèi)酯和3-芐基咪唑啉酮進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)并合成了一系列未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的3-芐基-5-(1-(4-甲基-2-氧代-1-氧雜螺[4,5]癸-3-烯-3-基) 亞乙基)-2-氨基咪唑啉-4-酮類化合物，并首次分離得到了Z-構(gòu)型的該類化合物。經(jīng)HPLC 分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Z-和E-構(gòu)型化合物均可以在酸性條件下通過(guò)氮質(zhì)子化發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)化為E-和Z-構(gòu)型化合物。初步殺菌活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物9c、9d、9h 對(duì)油菜菌核病菌具有較好的離體抑制效果，化合物9c 的EC50值為14.3 mg/L；在400 mg/L 的劑量下，化合物9c 對(duì)黃瓜霜霉病和小麥白粉病具有較好的防治效果，防效分別達(dá)到80%和85%。3-位芐基的引入改善了該系列化合物的生物活性，其中化合物9c 表現(xiàn)出較好的生物活性，具有進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化的研究?jī)r(jià)值。