李春勇, 金 靜, 王 霞, 秦 曙

(山西農(nóng)業(yè)大學，山西功能農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(太原)，太原 030031)

殺蟲雙(thiosultap-disodium)是一種沙蠶毒素類神經(jīng)毒劑，對潛葉蛾和風蝶等害蟲有強烈的觸殺和胃毒作用，內(nèi)吸作用強，能被作物的葉、根等吸收和傳導，具有高效、低毒、低殘留等特點[1]，適用于防治水稻、蔬菜、果樹、棉花和小麥等作物上的多種蟲害[2]。殺蟲雙與目前已有的殺蟲劑無交互抗性，且對非靶標作物和環(huán)境安全。殺蟲雙雖已在大豆、甘蔗、果樹、蔬菜等作物上登記[3-4]，但尚未制定其在李子上的最大殘留限量(MRL)值[5]，也未見其在李子上的殘留行為報道。

殺蟲雙在酸性條件下穩(wěn)定，但在堿性條件下易降解為沙蠶毒素，如圖式1 所示。

目前，關于殺蟲雙的提取轉化、檢測方法有諸多報道。林濤等[6]建立了熱帶水果中殺蟲雙的超高效液相色譜-質譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)檢測方法，盤楊桂等[7]探索了甘蔗中殺蟲雙的氣相色譜(GC-FPD、GC-ECD) 的分析方法，朱慧敏等[8]采用氣相色譜法測定了葉菜類蔬菜上的殺蟲雙殘留量，但目前尚未見殺蟲雙在李子上的殘留分析方法。以上直接由液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)測定殺蟲雙含量或用氣相色譜方法測定由殺蟲雙轉化的沙蠶毒素含量的方法，普遍存在定量限高(LC-MS/MS 4.0 μg/kg) 、前處理過程有毒試劑用量大、轉化時間長、提取溶劑殘留干擾儀器測定等問題；另外，針對李子基質含糖量較高容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，本研究通過對前處理方法進行優(yōu)化，建立了一種將殺蟲雙快速轉化為沙蠶毒素，并結合高效液相色譜-串聯(lián)質譜 (HPLC-MS/MS) 檢測李子中沙蠶毒素含量，進而確定殺蟲雙殘留量的方法；并以GB 2763—2019 規(guī)定的殺蟲雙殘留物定義沙蠶毒素的含量推薦最大殘留限量(MRL)值，對全國6 地的殺蟲雙殘留量 (檢測去除果核后的整個果實，但殘留量計算包括果核) 進行長期膳食暴露風險概率計算，以期為保障農(nóng)產(chǎn)品安全、制定殺蟲雙在李子上的殘留限量標準提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

I-Class XEVO TQ-S Micro 液相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Waters 公司；GM300 刀式研磨儀，德國萊馳公司；5804 R、5824 R 離心機，Eppendorf Germany；LP2500 多管渦旋混合儀，萊普特科學儀器公司；XK80-A 快速混勻器，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；QUINTIX224-1CN、BS210S 和CAP8201 天平，賽多利斯科學儀器 (北京) 有限公司。

殺蟲雙 (thiosultap-disodium) 標準品 (純度99.0%) ，Dr. Ehrenstorfer 公司；沙蠶毒素草酸鹽(nereistoxin oxalate) 標準品 (純度99.0%) ，Dr.Ehrenstorfer 公司；質量分數(shù)為18%的殺蟲雙水劑，安徽華星化工有限公司；正己烷和乙腈 (色譜純) ，TEDIA?；甲醇 (色譜純) ，MERCK LiChrosolv?；甲酸 (色譜純) ，F(xiàn)isher chemical Optima?；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。試驗用水為蒸餾水。

1.2 田間試驗

按照《農(nóng)藥殘留試驗準則》[9]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程》[10]設置試驗小區(qū)，每小區(qū)2 棵李子樹，重復3 次，小區(qū)間設保護帶，另設清水對照小區(qū)。供試藥劑為18%殺蟲雙水劑。

1.2.1 消解動態(tài)試驗 試驗分別在山西省晉中市榆次區(qū)東陽鎮(zhèn)和北京市大興區(qū)長子營鎮(zhèn)兩地進行。按有效成分540 mg/kg (1.5 倍推薦劑量) 于李子生長至成熟個體一半大小時施藥，分別于施藥后2 h 及1、3、5、7、10、14、21、30 和45 d 采用隨機取樣法采樣：在李子樹的不同方向及上、中、下、里、外等不同部位采集24 個以上 (不少于2 kg) 生長正常、無病害的李子果實，去核后切成1 cm 左右的碎塊，混勻，四分法縮分留樣，用刀式研磨儀勻漿后取200 g，于 ?18 ℃貯存，備用。

1.2.2 最終殘留試驗 試驗分別在山西省、北京市、吉林省、河南省、山東省和貴州省6 地進行，按360 mg/kg (推薦劑量) 和540 mg/kg (1.5 倍推薦劑量) 施藥2～3 次，分別于施藥后10、15 和20 d 采集樣品，另設清水空白對照，采樣及樣品預處理方法同消解動態(tài)試驗。

1.3 樣品提取與凈化

稱取李子樣品5.0 g 于50 mL 離心管中，加入10 mL 含質量分數(shù)1%的L-半胱氨酸鹽酸鹽的0.1 mol/L 鹽酸溶液，于2 500 r/min 下渦旋振蕩30 min；加入5 mL 濃氨水及2 mL 質量分數(shù)為2%的氯化鎳水溶液后繼續(xù)渦旋30 min；加入10 mL正己烷，渦旋5 min，于8 000 r/min 下離心5 min；取上清液2.0 mL，于40 ℃恒溫水浴氮氣吹干，用甲醇定容至2 mL，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，待測。

1.4 檢測條件

色譜條件：Waters Atiantis dC18色譜柱 (100 mm× 2.1 mm，5 μm) ；柱溫30 ℃；進樣量2 μL；流動相A 為0.1% 甲酸水溶液，流動相B 為甲醇，梯度洗脫程序見表1，流速0.2 mL/min，在此條件下沙蠶毒素的保留時間為1.19 min。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution condition

質譜條件：電噴霧離子源 (ESI+) ，多反應監(jiān)測 (MRM) 掃描模式；毛細管電壓3.3 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣和錐孔反吹氣均為高純氮氣，去溶劑氣溫度400 ℃；去溶劑氣流速650 L/h，錐孔反吹氣流速50 L/h；碰撞氣為高純氬氣，沙蠶毒素定量離子對150 > 105.0，碰撞能14 eV；定性離子對150 > 61.2，碰撞能18 eV。

1.5 標準溶液配制及標準曲線繪制

沙蠶毒素標準溶液及基質匹配標準溶液的配制：準確稱取0.016 g (精確至0.000 1 g) 沙蠶毒素草酸鹽標準品，用乙腈溶解并配制成質量濃度為1 000 mg/L 的沙蠶毒素標準儲備液，于 ?18 ℃密封保存。用乙腈稀釋沙蠶毒素標準儲備液，依次配制成100、10、1 mg/L 的標準溶液，再用李子空白提取液稀釋，配制成質量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.1、0.2、0.5 mg/L 的基質匹配標準液。

殺蟲雙標準溶液的配制：準確稱取0.01 g (精確至0.000 1 g) 殺蟲雙標準品，用乙腈溶解，配制成質量濃度為1 000 mg/L 的殺蟲雙標準儲備液，再用乙腈逐步稀釋，向5.0 g 李子空白樣品中添加不同濃度殺蟲雙標準溶液，添加水平分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 和10.0 mg/kg，經(jīng)1.3 節(jié)樣品提取與凈化，按1.4 節(jié)儀器條件檢測由殺蟲雙轉化后的沙蠶毒素含量，由殺蟲雙的添加量與沙蠶毒素的峰面積繪制標準曲線，求出樣品中殺蟲雙的殘留量，按公式 (1)～(3) 計算各個添加量殺蟲雙向沙蠶毒素的轉化率。

式中：α1為殺蟲雙向沙蠶毒素的理論轉化率，%；M1為沙蠶毒素摩爾質量，g/mol；M2為殺蟲雙摩爾質量，g/mol；α2為殺蟲雙向沙蠶毒素的實際轉化率，%；с為殺蟲雙添加量，g/kg；R為殺蟲雙添加量對應的殘留值，g/kg；α為殺蟲雙向沙蠶毒素的轉化率。

1.6 添加回收試驗

在空白李子樣品中添加殺蟲雙標準溶液，添加水平分別為0.01、0.1 和5 mg/kg，按1.3 節(jié)的方法提取、凈化，按1.4 節(jié)的條件檢測，計算添加回收率和相對標準偏差。

1.7 長期膳食攝入風險評估

長期膳食攝入風險參數(shù)按公式(4) 和 (5) 計算[11-12]：

式中，NEDI 為國家估算每日攝入量，mg/kg bw；STMRi為農(nóng)藥在各類初級食用農(nóng)產(chǎn)品中的規(guī)范殘留試驗中值，mg/kg；STMR-Pi為加工因子校正后的規(guī)范殘留試驗中值，mg/kg；Fi為一般人群對該食品的消費量，kg；bw 為人體重，kg，中國人群平均體重按63kg 計；RQ 為風險概率，%；ADI 為農(nóng)藥的每日允許攝入量，mg/kg bw。根據(jù)《食品中農(nóng)藥殘留風險評估指南》[13]計算NEDI值，膳食數(shù)據(jù)以各類登記作物總的膳食攝入量計算，無法查閱到殘留中值的依據(jù)風險最大化原則使用MRL 值。RQ≤1 時，可認為殘留量對一般人群健康的影響在可接受范圍內(nèi)，比值越小，風險越低，并在膳食風險評估的基礎上推薦合適的MRL 值[14]。

2 結果與分析

2.1 方法有效性評價

本研究中樣品經(jīng)含有L-半胱氨酸鹽酸鹽的鹽酸提取，濃氨水-氯化鎳轉化，正己烷萃取后，采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜 (HPLC-MS/MS) 檢測，方法簡便高效、穩(wěn)定性好。由表2 可知，在李子中不同濃度的殺蟲雙向沙蠶毒素的轉化率不同，隨著添加濃度的增加其轉化率呈下降趨勢，因此按照1.5 節(jié)繪制標準曲線進行定量更加準確。在0.050～10mg/kg 范圍內(nèi)，沙蠶毒素峰面積 (y) 與殺蟲雙含量 (x) 間呈冪函數(shù)相關：y= 752 635x0.7451，R2= 0.992。沙蠶毒素定量限為0.01mg/kg。

表2 殺蟲雙向沙蠶毒素的轉化率Table 2 The conversion rate of thiosultap-disodium to nereistoxin

在0.01、0.1 和5 mg/kg 3 個添加水平下，殺蟲雙在李子中的平均回收率在77%～100%之間，RSD在6%～18%之間，符合農(nóng)藥殘留檢測要求[15]。

2.2 消解動態(tài)試驗

消解動態(tài)試驗結果(表3) 表明，殺蟲雙在李子上的消解規(guī)律符合一級反應動力學模型。從結果看，殺蟲雙在山西、北京李子中消解較快，半衰期分別為3.3 和4.8 d，整個試驗過程中，殺蟲雙在李子中的殘留量呈遞減趨勢。

表3 殺蟲雙在李子中的消解動態(tài) (2019 年)Table 3 Dissipation of thiosultap-disodium in plum (2019)

2.3 最終殘留量試驗

最終殘留試驗結果 (表4) 表明：采收間隔期為10 d 時，殺蟲雙在李子中的殘留量在0.011～0.93 mg/kg 之間，規(guī)范殘留試驗中值 (STMR) 為0.042 mg/kg，最高殘留量 (HR) 為0.93 mg/kg；采收間隔期為15 d 時，殺蟲雙在李子中的殘留量在<0.010～1.4 mg/kg 之間，STMR 為0.020 mg/kg，HR 為1.4 mg/kg；采收間隔期為20 d 時，殺蟲雙在李子中的殘留量在<0.010～0.61 mg/kg 之間，STMR 為0.018 mg/kg，HR 為0.61 mg/kg?？梢姡瑲⑾x雙在李子中的STMR 隨采樣間隔期的延長而降低，與消解動態(tài)規(guī)律一致。

表4 殺蟲雙在李子中的最終殘留量Table 4 The terminal residues of thiosultap-disodium in plum

2.4 李子中殺蟲雙在長期膳食攝入風險中所占份額

長期膳食攝入風險評估是依據(jù)中國居民營養(yǎng)與健康狀況監(jiān)測調查數(shù)據(jù)[16]，結合規(guī)范殘留試驗中值或最大殘留限量計算國家估算每日攝入量。由于殺蟲雙僅在中國登記使用，對其急性毒性和風險的理解與評價意義可能遠大于長期膳食暴露，因此本研究主要對比不同計算模型下李子中殺蟲雙在長期膳食攝入風險中所占份額，其中李子采用的是在臨界良好農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)范 (cGAP) 條件下殺蟲雙在李子中的殘留試驗中值，按有效成分360 mg/kg 施藥3 次，距最后一次施藥10 d 時的STMR 值為0.025 mg/kg，其他登記作物的殘留中值來源于 “《食品安全國家標準 農(nóng)藥最大殘留限量標準》制定文本” 的編制說明部分。由評估結果(表5) 表明，由STMR、HR 和MRL 值計算的膳食攝入量分別為0.17、0.70 和0.80 mg，李子中殺蟲雙對應所占的風險份額分別為0.89%、4.93%和0.76%。

表5 李子中殺蟲雙在長期膳食風險中所占份額Table 5 Share of thiosultap-disodium in plums in long-term dietary risk

3 結論與討論

根據(jù)2019 年在山西、北京、吉林、河南、山東和2020 年貴州6 地進行的田間試驗結果表明，18%殺蟲雙水劑按有效成分360、540 mg/kg 劑量施藥2～3 次，于末次施藥20 d 后采樣，李子中殺蟲雙殘留量在 <0.010～0.61 mg/kg 之間。使用18%殺蟲雙水劑防治果樹害蟲時，建議按有效成分540 mg/kg (最高制劑用藥量333 倍液) 最多施藥3 次，安全采收間隔期15 d。

沙蠶毒素類農(nóng)藥有多種，本研究只討論殺蟲雙的殘留。殺蟲雙難以氣化，不能用氣相色譜直接測定，通過優(yōu)化前處理方法：樣品經(jīng)含質量分數(shù)1%的L-半胱氨酸鹽酸鹽的0.1 mol/L 鹽酸高速渦旋提取，有效解決了乳化問題，經(jīng)濃氨水-氯化鎳轉化，利用HPLC-MS/MS 直接檢測由殺蟲雙轉化的沙蠶毒素。由表2 可知，在李子中不同濃度的殺蟲雙向沙蠶毒素的轉化率不同，且隨濃度的增加呈下降的趨勢，為準確定量，本研究采用由殺蟲雙的添加量與沙蠶毒素的峰面積做的標準曲線來計算樣品中殺蟲雙的殘留量。方法簡便快速、穩(wěn)定性好、靈敏度高，減少了有機溶劑的用量，可為殺蟲雙在其他作物中的殘留檢測提供參考。

目前，中國尚未制定殺蟲雙在李子中的MRL值，根據(jù)殺蟲雙在中國登記批準的良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(GAP) 數(shù)據(jù)和規(guī)范殘留試驗，按照《農(nóng)產(chǎn)品及食品中農(nóng)藥殘留風險評估應用指南》[13]和《農(nóng)產(chǎn)品及食品中農(nóng)藥最大殘留限量制定指南》[14]，結合18%殺蟲雙水劑所推薦的安全采收間隔期 (15 d) 的HR 值0.58 mg/kg (以沙蠶毒素計) ，建議殺蟲雙(以沙蠶毒素計) 在李子上的MRL 值暫定為2 mg/kg?；谂R界良好農(nóng)業(yè)生產(chǎn)規(guī)范條件下得到的殘留試驗中值，對中國登記作物上使用的殺蟲雙在長期膳食攝入風險中所占份額進行計算，據(jù)表5 可知，由STMR 計算的膳食攝入量為0.17 mg，而由HR 或MRL 值計算的攝入量為0.70/0.80 mg，已超過殺蟲雙日允許攝入量 (0.63 mg) 。綜觀李子中殺蟲雙在膳食攝入中所占份額：STMR (0.89%) ，HR (4.93%) ，MRL (0.76%) ，可見，利用HR 或MRL 進行李子中殺蟲雙膳食攝入量計算將大幅度增加不確定度，因此在進行膳食風險評估過程中應謹慎使用HR 或MRL 值代替STMR 值。目前，糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥殘留聯(lián)合專家會議(JMPR) 、歐盟和國際食品法典委員會 (CAC) 等均沒有殺蟲雙的急性參考劑量 (ARfD) 值，因此，不斷完善相應數(shù)據(jù)，對精確評估膳食攝入風險及推薦合理的MRL 值具有科學和現(xiàn)實意義。