楊 靜，李艷艷，單雪峰

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400016； 2.重慶市中醫(yī)院藥劑科，重慶 400021)

小兒黃龍顆粒是重慶希爾安藥業(yè)有限公司開發(fā)的用于治療注意缺陷多動障礙的中藥組合物顆粒(批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字Z20143009)，其成分包括熟地黃、白芍、麥冬、知母、五味子、煅龍骨、煅牡蠣、黨參、石菖蒲、遠(yuǎn)志和桔梗等11味中藥[1-2]。其中，白芍、熟地黃和麥冬為君藥，起著重要的滋陰補腎、平肝潛陽和安神定志的作用，臨床研究結(jié)果顯示，小兒黃龍顆粒治療注意缺陷多動障礙，能有效提高治療效率，減輕患兒臨床癥狀，提高患兒認(rèn)知功能[3-7]。白芍、熟地黃和麥冬的有效成分分別為芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元，因此，控制上述3種成分的含量是保證小兒黃龍顆粒產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。目前，小兒黃龍顆粒國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(YBZ00892011)中只控制了芍藥苷的含量。若增加毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元的含量檢測，根據(jù)文獻(xiàn)報道，只能采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)分別檢測，檢測時間長，效率低[8-9]。本研究探討采用HPLC切換波長的方法同時測定小兒黃龍顆粒中芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元的含量，為小兒黃龍顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-2030C型高效液相色譜儀，LabSolutions色譜工作站(日本島津公司)；CP225D型電子分析天平、BS124S型電子分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；KQ5200B型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷對照品(批號：110736-201943；含量：95.1%)，毛蕊花糖苷對照品(批號：111530-201914；含量：95.2%)，魯斯可皂苷元對照品(批號：111909-201906；含量：98.5%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；小兒黃龍顆粒(規(guī)格：5 g/袋；批號：190801、190802和190803)，由重慶希爾安藥業(yè)有限公司提供；甲醇、乙腈、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)為色譜純；水為純化水；磷酸、三乙胺以及其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱為Agela Venusil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%SDS)-三乙胺(V∶V∶V=15 ∶ 84 ∶ 1)，流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，采用二極管陣列紫外檢測器分別在230、334和397 nm波長處測定芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元的含量[10-12]。在上述色譜條件下，芍藥苷在230 nm波長下的色譜峰與其他色譜峰呈基線分離，分離度>2.0；毛蕊花糖苷在334 nm波長下的色譜峰與其他色譜峰呈基線分離，分離度>3.0；魯斯可皂苷元在397 nm波長下的色譜峰與其他色譜峰呈基線分離，分離度>2.0。

2.2 溶液的配制

2.2.1 芍藥苷對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加適量的70%甲醇溶液，超聲處理10 min(功率為200 W，頻率為40 kHz)，冷卻后加甲醇定溶稀釋成質(zhì)量濃度為500 μg/ml的儲備液，再精密取儲備液1 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容稀釋成質(zhì)量濃度為50 μg/ml的溶液，搖勻，作為對照品溶液[13-14]。

2.2.2 毛蕊光糖苷對照品溶液的制備：精密稱取毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加適量的70%甲醇溶液，超聲處理10 min(功率為200 W，頻率為40 kHz)，冷卻后加甲醇定溶稀釋成質(zhì)量濃度為200 μg/ml的儲備液，再精密取儲備液1 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇定溶稀釋成質(zhì)量濃度為20 μg/ml的溶液，搖勻，作為對照品溶液[15-16]。

2.2.3 魯斯可皂苷元苷對照品溶液的制備：精密稱取魯斯可皂苷元對照品適量，精密稱定，加適量的70%甲醇溶液，超聲處理10 min(功率為200 W，頻率為40 kHz)，冷卻后加甲醇定溶稀釋成質(zhì)量濃度為500 μg/ml的儲備液，再精密取儲備液1 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇定溶稀釋成質(zhì)量濃度為50 μg/ml的溶液，搖勻，作為對照品溶液[17]。

2.2.4 供試品溶液的制備：取樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，加適量的70%甲醇溶液，超聲處理10 min(功率為200 W，頻率為40 kHz)，冷卻后加甲醇稀釋定容至50 ml，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試液。

2.2.5 陰性對照溶液的配制：按照“2.2.4”項下供試品溶液的制備方法，分別制備不含白芍藥材或不含熟地黃藥材或不含麥冬藥材的陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液以及陰性供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖1。在上述色譜條件下，在相應(yīng)檢測波長下，供試品色譜圖中，毛蕊花糖苷或芍藥苷與其他組分峰基線分離較好，供試品中毛蕊花糖苷或芍藥苷與相應(yīng)對照品在相同保留時間有相同色譜峰，且陰性對照均在主成分出峰處不出峰，表明本方法專屬性好。

A.334 nm毛蕊花糖苷對照品溶液色譜峰；B.334 nm供試品溶液色譜峰；C.334 nm不含熟地黃藥材的陰性對照溶液色譜峰；D.230 nm芍藥苷對照品溶液色譜峰；E.230 nm供試品溶液色譜峰；F.230 nm不含白芍藥材的陰性對照溶液色譜峰；G.397 nm魯斯可皂苷元對照品溶液色譜峰；H.397 nm供試品溶液色譜峰；I.397 nm不含麥冬藥材的陰性對照溶液色譜峰

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項下各對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和2.0 ml置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測。以峰面積Y對進(jìn)樣量(ng)進(jìn)行線性回歸，分別在230、334和397 nm波長處，芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元進(jìn)樣量分別在100～1 000、40～400和100～1 000 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為Y=3 946X+540(r=0.999 7)、Y=9 463X+1 064(r=0.999 8)和Y=4 246X+465(r=0.999 9)[18-20]。

2.5 檢測限和定量限

分別精密量取“2.2”項下單一對照品溶液適量，逐級稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為 10 ∶ 1時，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時，得檢測限。結(jié)果顯示，芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元的定量限分別為20、8和20 ng，檢測限分別為8、3和8 ng。

2.6 中間精密度試驗

取樣品內(nèi)容物細(xì)粉(批號：190801)約1.0 g，由2名不同分析人員于不同日期按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果顯示，芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元峰面積的RSD分別為1.2%、2.0%和1.0%(n=6)，表明本方法中間精密度良好，見表1。

表1 中間精密度試驗結(jié)果(n=12)

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液(批號：190801)7份，分別于室溫(25 ℃)下放置0、2、4、6、8、12和24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元峰面積的RSD分別為0.91%、0.81%和0.76%(n=7)，表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取樣品內(nèi)容物細(xì)粉(批號：190801)適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果顯示，芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元含量的平均值分別為12.49、4.05和1.24 mg/5 g，RSD分別為0.89%、0.93%和0.86%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品內(nèi)容物細(xì)粉(批號：190801)適量， 共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的單一對照品溶液適量，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.10 耐用性試驗

分別通過色譜柱條件改變、流動相比例變化、流動相流速變化和色譜柱溫度變化時，測定同一供試品的含量，計算RSD，考察方法的耐用性。結(jié)果顯示，色譜柱、流動相、流速和柱溫等改變時，RSD分別為0.81%、1.23%、0.81%和0.81%，說明色譜條件適宜，含量測定準(zhǔn)確，重現(xiàn)性和可信性較好。

2.11 樣品含量測定

取3批樣品適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3，mg/5 g)

3 討論

白芍、熟地黃和麥冬的有效成分分別為芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元，因此，在《中華人民共和國藥典》中，要測定白芍、熟地黃和麥冬的含量，常通過測定其有效成分芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元等的含量來實現(xiàn)。本研究首次運用HPLC切換波長的方法同時測定小兒黃龍顆粒中芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元的含量。

本研究在樣品的提取、流動相的選擇方面進(jìn)行了深入探索，所得供試品色譜圖中分別在230、334和397 nm波長處出現(xiàn)芍藥苷、毛蕊花糖苷和魯斯可皂苷元色譜峰，目標(biāo)成分與相鄰峰之間分離度好、峰形尖銳、對稱性好，理論板數(shù)>4 000，各項參數(shù)能滿足HPLC法的相關(guān)要求。

線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率等試驗結(jié)果表明，本研究建立的小兒黃龍顆粒中毛蕊花糖苷、芍藥苷和魯斯可皂苷元含量的HPLC測定法，準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性好，且操作簡便快速，可一次性完成3種重要成分的含量測定，可作為小兒黃龍顆粒質(zhì)量內(nèi)控方法之一。