武霽舟，王省

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/轉(zhuǎn)化系統(tǒng)生物學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究中心/中醫(yī)腦病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023）

自噬廣泛存在于真核生物，與各種生理活動(dòng)和病理變化密切相關(guān)[1]。自噬作為促生存機(jī)制[2-3]，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)改變或機(jī)體受到刺激時(shí)，能夠清除胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡和壞死，在維持能量代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面起著重要作用[4]。細(xì)胞自噬還可以引起II型程序性細(xì)胞死亡，以清除受損細(xì)胞[5]，但過度激活可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[6]。

α-生育酚是維生素E的一種存在形式，具有很強(qiáng)的抗氧化能力[7-9]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化能力和自噬具有一定聯(lián)系[10-12]。因此，本研究在此基礎(chǔ)上，以HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞為研究對象，觀察自噬現(xiàn)象，探索α-生育酚對細(xì)胞自噬的影響以及可能的分子機(jī)制。

1 材料與設(shè)備

1.1 細(xì)胞

HT22海馬細(xì)胞由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院饋贈(zèng)。

1.2 藥物和試劑

1）α-生育酚（上海元葉生物科技有限公司，批號(hào)J01020RA14，BR，純度50%）；2）抗體LC3-II，p-AMPK，p-mTOR（Cell Signaling Technology公司，批號(hào)分別為12753s，2535s，2971s）；3）p62（Sigma公司，貨號(hào)P0067）；4）RAPA裂解液（碧云天，P0013K）；5）BSA（Biofroxx公司，貨號(hào)4240GR100）；6）PBS（HyClone，貨號(hào)SH30256.01）；7）Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，Gibco公司，貨號(hào)C11995500BT）；8）MTT（BioFroxx公司，貨號(hào)3580GR001）；9）0.25%Trypsin-EDTA（Gibco，貨號(hào)25200-056）。

1.3 儀器

1）垂直電泳槽（Bio-RAD，貨號(hào)041BR11339）；2）超微量生物檢測儀（NanoDrop 2000，貨號(hào)G402）；3）自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon-5200，貨號(hào)13T12NPFLI-1157）；4）高速離心機(jī)（Thermo Fisher，貨號(hào)75002455）。

2 方法

2.1 HT22細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

HT22細(xì)胞接種于10%FBS-DMEM完全培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，95%空氣，飽和濕度）進(jìn)行培養(yǎng)，1～2 d全量換液，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期的HT22細(xì)胞，接種于6孔/96孔微量培養(yǎng)板，在完全培養(yǎng)基處理24 h后，隨機(jī)分為4組：1）Control組：1%FBS-DMEM處理24 h；2）C.C組：15 μm compound C處理24 h；3）α-生育酚組：25 μm α-生育酚處理 24 h；4）C.C＋ α-生育酚組：15 μm compound C 和 25 μm α-生育酚共同處理24 h。

2.2 免疫熒光法（AO）檢測自噬溶酶體

將HT22細(xì)胞接種于6孔板，按照設(shè)定的分組處理后，細(xì)胞在由PBS配制的1 ug·mL-1AO溶液中室溫孵育10 min，使用PBS洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下觀察樣品。

2.3 透射電鏡（TEM）檢測自噬體

細(xì)胞按設(shè)定的分組處理后，收集細(xì)胞置于2.5%戊二醛溶液固定、PBS洗滌、1%四氧化鋨溶液固定、PBS洗滌、梯度乙醇脫水、非環(huán)氧樹脂單體包埋。超薄切片60～80 nm后，用3%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡觀察自噬體。

2.4 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

將細(xì)胞接種于6孔板，按照設(shè)定的分組處理后，消化并收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后于冰上使用裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測定并調(diào)整蛋白濃度，加熱變性后于-20℃冰箱保存。每組取等量蛋白進(jìn)行電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上后，于1%BSA封閉1 h，加入適當(dāng)稀釋的一抗，4℃搖床過夜，TBST緩沖溶液洗膜3次，每次10 min，再加入適當(dāng)稀釋的二抗，室溫?fù)u床結(jié)合1 h，TBST緩沖溶液洗膜三次后置于顯影液中，顯色、曝光。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean± SEM）表示，使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單向方差分析（ANOVA）和Bonferroni方法分析組差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記

與對照組比較，C.C＋α-生育酚組的橙色溶酶體數(shù)量明顯增加（見圖A）。

圖A α-生育酚對橙色溶酶體的影響[圖1-3（10X）；圖4-6（40X）]

3.2 透射電鏡觀察自噬體

按設(shè)定分組處理后，C.C預(yù)處理組自噬體數(shù)量顯著降低（P＜0.01），而α-生育酚增加了自噬體的數(shù)量（見圖B、C）。

圖B/C α-生育酚對自噬體數(shù)量的影響

3.3 Western Blot 檢測結(jié)果

α-生育酚通過抑制HT22細(xì)胞中mTOR激酶的表達(dá)而誘導(dǎo)自噬（見圖D）。與對照組相比，預(yù)處理α-生育酚能夠顯著降低由C.C誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ的表達(dá)（a，P＜0.01），上調(diào)了P62的表達(dá)（b，P＜0.001）。α-生育酚能夠激活胞內(nèi)p-AMPK的表達(dá)，但不能逆轉(zhuǎn)C.C對p-AMPK表達(dá)的抑制（c，相對于CTL組，P＜0.01；相對于C.C組，P＞0.05）。α-生育酚可以下調(diào)p-mTOR的表達(dá)（d，相對于C.C組，P＜0.05；相對于CTL組，P＜0.01）。C.C抑制ULK1的表達(dá)（e，P＜0.05，相對于CTL組）；α-生育酚能夠逆轉(zhuǎn)C.C對ULK1激酶的抑制作用，提高其表達(dá)水平（e，P＜0.05）。

圖D α-生育酚作用HT22細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

4 討論

LC3的表達(dá)水平與自噬相關(guān)[13]，刺激自噬體的形成與抑制自噬體的降解均可導(dǎo)致LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高。LC3-Ⅱ參與了自噬的全過程，能與新形成的膜相結(jié)合，直到自噬溶酶體的形成，其相對量與自噬體含量相關(guān)，其表達(dá)水平間接反應(yīng)了自噬水平的高低[14]，這種LC3亞型也是目前檢測自噬體時(shí)最常用的分子標(biāo)記之一。我們發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ和LC3-I的總和在同一樣品中不一定相同，考慮到LC3抗體對LC3-Ⅱ的親和力可能高于LC3-Ⅰ，因此我們的研究只考慮了LC3-Ⅱ的水平。經(jīng)α-生育酚干預(yù)后，HT22細(xì)胞自噬現(xiàn)象明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為AO染色下橙色溶酶體數(shù)量明顯增多，透射電鏡下觀察自噬體顯著增加，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào)及p62水平降低。

mTOR是雷帕霉素的靶分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可多種蛋白相互作用，主要形成兩種不同的蛋白質(zhì)復(fù)合物mTORC1和mTORC2[15]，其中mTORC1參與了ULK1復(fù)合物的調(diào)控[16]。mTORC1下游有三種不同的途徑，包括4EBP1，P70S6K1和S6激酶[17]，其中4EBP1和P70S6K1是mTOR激酶的真核翻譯起始因子的兩種調(diào)節(jié)劑。有絲分裂原和生長因子可激活P70S6K1并隨后磷酸化S6激酶，激活自噬?；罨癄顟B(tài)的mTORC1復(fù)合體通過磷酸化ULK1、ATG13、ATG101和FIP200組成的ULK1復(fù)合體來抑制細(xì)胞自噬，降低ULK1激酶的活性；而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的信號(hào)通過抑制mTORC1激活ULK1復(fù)合體，促進(jìn)自噬的啟動(dòng)[18]。

除mTORC1以外，ULK1復(fù)合物的水平還受能量感受器AMPK的調(diào)控[19]。隨著對AMPK功能及作用機(jī)制的研究深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)AMPK可以直接作用于ULK1調(diào)控自噬[20]。Compound Cs是AMPK特異性抑制劑[21]，本研究通過Compound C特異性抑制HT22細(xì)胞AMPK表達(dá)，進(jìn)而降低細(xì)胞自噬水平作為自噬抑制模型，然后予以α-生育酚處理觀察其對自噬的影響以及明確α-生育酚自噬信號(hào)通路機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C.C組能降低細(xì)胞自噬水平，加入α-生育酚干預(yù)后細(xì)胞自噬顯著提高，細(xì)胞內(nèi)ULK1表達(dá)上調(diào)，p-mTOR水平下降。但α-生育酚并沒有提高AMPK的表達(dá)水平，提示AMPK不是α-生育酚誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵分子，其自噬誘導(dǎo)信號(hào)機(jī)制可能與抑制mTOR/ULK1信號(hào)通路有關(guān)。綜上，α-生育酚可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，AMPK不是α-生育酚誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵分子，其信號(hào)機(jī)制可能與抑制mTOR/ULK1信號(hào)通路有關(guān)。