劉茜,張馨語,王琰,王安宇,趙藝,龍子仙,劉思寧,牒云,黃琳娟*

1(陜西省天然多糖資源利用工程研究中心,西安市糖生物學與糖工程重點實驗室,西北大學 食品科學與工程學院,陜西 西安,710069) 2(西北大學 生命科學學院,陜西 西安,710069)

我國是“素中之葷”黑木耳的故鄉(xiāng),中華民族早在4 000多年前的神農(nóng)氏時代便開始栽培并食用黑木耳,《禮記》中也有關(guān)于帝王宴會上食用黑木耳的記載。目前,我國黑木耳年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的90%以上,以東北黑木耳尤為知名,僅黑龍江省東寧縣黑木耳的產(chǎn)量就高達全國產(chǎn)量的20%[1]。黑木耳性平、味甘,可食、可藥、可補,《本草綱目》中記載“益氣不饑,輕身強志,斷谷治痔”[2-3]。多糖是黑木耳子實體中重要的活性成分,具有抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、調(diào)節(jié)糖脂代謝等活性[4-6]?！靶∧径?大產(chǎn)業(yè)”,陜西秦巴山區(qū)森林茂密、光照充足、氣候濕潤、夏秋晝夜溫差大,也具有適合黑木耳生長的條件[7-8]。然而,關(guān)于西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖資源的研究及其開發(fā)利用鮮有報道。

活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能,不同的提取方法往往會影響天然多糖的產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)特性和生物活性[9-11]。水提法是提取多糖的最為傳統(tǒng)的方法,成本低廉、操作簡單,且可以保持多糖的完整結(jié)構(gòu),但提取過程繁瑣耗時[12]。超聲波可以破壞植物細胞壁的結(jié)構(gòu),加速多糖從細胞中溶出,但長時間可能導致多糖糖苷鍵斷裂[13]。酶解提取法反應(yīng)條件溫和、雜質(zhì)容易分離、得率高,但酶的活性受溫度和pH的影響較大,且酶制劑成本較高,難以大規(guī)模應(yīng)用[14]。LI等[15]發(fā)現(xiàn)酶法提取東北黑木耳多糖的得率顯著大于水提和超聲提取。BIAN等[16]以黑龍江伊春來源的黑木耳為研究材料,采用超聲輔助提取出具有較好抗凝血活性的黑木耳酸性多糖,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖組成,摩爾比為80.63∶9.88∶2.25∶1∶31.13。另有研究表明,與低分子質(zhì)量(<10 kDa)黑木耳多糖相比較,高分子質(zhì)量(10～50 kDa 或>100 kDa)的黑木耳多糖具有更強的免疫刺激作用[17]。

基于此,本實驗比較了西北秦巴山區(qū)及東北黑龍江黑木耳多糖的理化性質(zhì)及抗氧化活性差異,并分別采用熱水提取、酶法提取和超聲提取3種方法從秦巴山區(qū)黑木耳中提取黑木耳粗多糖,考察不同提取方法對其糖含量、糖醛酸含量、分子質(zhì)量、單糖組成等理化性質(zhì)的影響,并通過檢測Fe2+螯合能力、還原力和過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)清除能力比較其體外抗氧化活性,以期為黑木耳多糖構(gòu)效關(guān)系研究奠定理論基礎(chǔ),并為西北秦巴山區(qū)特色資源黑木耳的合理開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西北黑木耳,陜西天美綠色產(chǎn)業(yè)有限公司,產(chǎn)地為西北秦巴山區(qū)；東北黑木耳,廈門綠帝生態(tài)股份有限公司,產(chǎn)地為黑龍江省牡丹江市。

纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶,美國Sigma-Aldrich公司；標準單糖及葡聚糖標準品,美國Fluka公司；無水乙醇、正丁醇、二氯甲烷、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、雞白蛋白、考馬斯亮藍G250、磷酸、糖醛酸、咔唑、冰醋酸、甲醇、乙酸酐、吡啶、三氟乙酸、硼氫化鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、菲啰嗪、鐵氰化鉀、三氯化鐵、30% H2O2溶液等,天津大茂有限公司。

1.2 主要設(shè)備

KQ-500DE型數(shù)字超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；HC—2518型高速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司；UV-1000型紫外分光光度計,翱藝有限公司；GC-2010型氣相色譜儀、LC-2010A高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑木耳多糖的提取

樣品預處理：將不同產(chǎn)地黑木耳子實體分別用蒸餾水洗凈,60 ℃烘箱風干,粉碎機碾碎,40目過篩,存儲在4 ℃待用。

水溶性多糖的提?。悍謩e稱取30 g黑木耳粉狀樣品按照料液比(g∶mL)1∶50加入蒸餾水,一份用100 ℃水提取2次,每次2 h；一份浸泡30 min后,加入1.75%復合酶(果膠酶與纖維素酶質(zhì)量比為1∶1于pH 5.0時50 ℃水浴80 min后加入2%木瓜蛋白酶,于pH 6.0時60 ℃水浴60 min；另一份在75 ℃水浴45 min后,于功率為100 W、溫度為65 ℃的條件下超聲15 min。將溶液于10 000 r/min下離心10 min,取上清液濃縮。濃縮后按1∶4體積比加入無水乙醇,醇沉12 h。

除蛋白、除小分子雜質(zhì)：將醇沉12 h后的樣品于10 000 r/min 離心10 min,去上清液,留取濾渣,溶于水中,待充分溶解后,用Sevage法除蛋白。配制V(二氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1的混合溶液,加入Sevage試劑,攪拌20 min,使蛋白質(zhì)充分反應(yīng)變性后沉淀出來,10 000 r/min離心10 min。取上清液,棄去沉淀層和有機層,重復4～5次。采用分子截流量為3 000 Da的玻璃紙在流動的自來水中透析3 d,濃縮、冷凍干燥、最后稱量裝袋,獲得黑木耳粗多糖樣品。

1.3.2 黑木耳多糖理化性質(zhì)測定

參照本課題組已有方法[18-19],采用苯酚-硫酸法測定樣品中糖含量,考馬斯亮藍法測定蛋白含量,硫酸-咔唑法測定多糖樣品中的糖醛酸含量。

采用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)檢測多糖樣品平均分子質(zhì)量[20]。用磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L,pH 6.0)將多糖標準品(1、5、12、15、50、80、150、270 kDa)及黑木耳多糖樣品均配制為質(zhì)量濃度2.0 mg/mL的溶液。10 000 r/min 離心10 min除雜,取上清液待測。采用LC-2010A高效液相色譜儀,TSK-Gel G4000PWxL色譜柱,示差折光檢測器,流速設(shè)定為0.3 mL/min,進樣體積為20 μL。以出峰時間-分子質(zhì)量的對數(shù)值繪制標準曲線,并通過標準曲線的回歸方程計算多糖分子質(zhì)量。

根據(jù)DENG等[20]的方法對黑木耳粗多糖樣品進行單糖組成分析。將粗多糖樣品經(jīng)酸水解、還原乙酰化后得到糖醇乙酸酯衍生物,用氣相色譜儀進行檢測。Rtx-50毛細管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm),FID檢測器,在壓力為110 kPa條件下以N2和空氣作為載氣,流速為0.88 mL/min,分流比為19∶1。程序升溫條件：180 ℃保持2 min后,依次以6 ℃/min的速率升溫至210 ℃,0.3 ℃/min的速率升溫至215 ℃,6 ℃/min的速率升溫至240 ℃；當溫度升至240 ℃后保持30 min。

1.3.3 黑木耳多糖體外抗氧化活性測定

將黑木耳多糖配制成不同濃度溶液,參照KIM等[21]、李有媛等[22]的方法,測定不同黑木耳多糖樣品的還原力；參照李珊等[23]的方法,測定不同黑木耳多糖樣品的Fe2+金屬螯合力；參照DING等[24]的方法,測定不同黑木耳多糖樣品對H2O2的清除能力。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖的提取及理化性質(zhì)表征

經(jīng)沸水提取、濃縮、醇沉、脫蛋白及透析凍干后得到西北秦巴山區(qū)黑木耳粗多糖樣品和對照東北牡丹江黑木耳粗多糖樣品,2組樣品均為灰褐色蓬松絮狀物。秦巴山區(qū)黑木耳粗多糖提取率為5.33%,牡丹江黑木耳粗多糖提取率為5.41%,無明顯差異。

如表1所示,西北秦巴山區(qū)黑木耳粗多糖與對照組東北牡丹江黑龍江黑木耳粗多糖糖含量分別為(53.15±4.52)%、(60.98±3.25)%,無顯著性差異(P>0.05)。秦巴山區(qū)黑木耳粗多糖糖醛酸含量為(11.04±0.59)%,東北黑木耳粗多糖糖醛酸含量為(10.54±0.68)%,無顯著性差異(P>0.05)；而秦巴山區(qū)黑木耳多糖中蛋白含量為(1.45±0.12)%,顯著低于東北黑木耳多糖蛋白含量(P<0.05)。產(chǎn)地不同黑木耳多糖中結(jié)合蛋白含量有顯著性差異,可能是由于地區(qū)溫度、濕度等環(huán)境因素所致,東北地區(qū)屬溫帶大陸季風氣候,有著特殊的地貌及濕潤的氣候環(huán)境,適宜黑木耳生長和蛋白質(zhì)的積累[25]。

表1 秦巴山區(qū)黑木耳多糖糖含量、蛋白含量及糖醛酸含量 單位：%

由圖1和表2可知,水提西北秦巴山區(qū)黑木耳粗多糖和水提東北牡丹江黑木耳粗多糖單糖組成基本相同,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和葡萄糖組成,且各組分比例相似,以甘露糖和葡萄糖醛酸含量較多,甘露糖含量約是葡萄糖醛酸含量的3倍。

單糖標準：1～9分別代表鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、葡萄糖醛酸(GlcA)和半乳糖醛酸(GalA)(下同)圖1 西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖的單糖組成氣相色譜圖Fig.1 Monosaccharide composition GC chromatogram of A.auricula polysaccharides from northwest Qinba mountain

表2 西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖單糖組成相對摩爾百分比 單位：%

2.2 秦巴山區(qū)黑木耳多糖體外抗氧化活性

樣品的還原力大小即反映樣品的總抗氧化能力的強弱。還原劑可以將鐵氰化物中的三價鐵離子還原成亞鐵離子,反應(yīng)混合物從黃色逐漸變?yōu)榫G色和藍色,吸光度越高表示還原能力越強。西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖的還原能力如圖2-a所示,在實驗濃度范圍內(nèi),西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖和對照東北牡丹江黑木耳多糖均有較強的還原力,且呈劑量依賴關(guān)系。低濃度(0.625～1.25 mg/mL)時,西北黑木耳粗多糖反應(yīng)混合物在700 nm時的吸光度顯著高于東北黑木耳粗多糖(P<0.05)；當濃度>2.5 mg/mL時,東北黑木耳粗多糖還原力與西北黑木耳粗多糖還原力無顯著性差異(P>0.05)。

Fe2+極易催化脂質(zhì)、蛋白質(zhì)氧化,引起細胞損傷,因此金屬螯合能力越強,抗氧化能力越好。Fe2+與菲啰嗪形成有色化合物,該化合物在562 nm處有最大光吸收。樣品溶液與Fe2+螯合后,其吸光度降低越多,表明它的抗氧化活性越高。由圖2-b可知,在實驗濃度范圍內(nèi),不同產(chǎn)地黑木耳多糖均有良好的Fe2+金屬螯合能力。低濃度(0.3125～0.625 mg/mL)時,西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖螯合能力為4.42%～4.43%,顯著強于東北黑木耳多糖螯合能力(2.75%～3.14%)(P<0.05)；當質(zhì)量濃度為1.25～5 mg/mL時,西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖和東北牡丹江黑木耳多糖螯合能力無顯著性差異(P>0.05)；在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時,對照東北黑木耳表現(xiàn)出比西北秦巴山區(qū)黑木耳更強的金屬螯合能力(P<0.05),兩者分別為58.14%和39.53%。

生物體處于氧化和抗氧化應(yīng)激平衡中,過多的自由基會攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等生物大分子,與阿爾茲海默病、糖尿病、心血管疾病等的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[26-27]。如圖2-c所示,西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖和對照東北黑木耳多糖在實驗濃度范圍內(nèi)均可以顯著清除H2O2,且呈現(xiàn)濃度依賴性。在低濃度范圍內(nèi)(≤1 mg/mL)時,西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖和東北黑木耳多糖的清除能力無顯著性差異(P>0.05)。當濃度≥1.25 mg/mL時,東北黑木耳多糖清除H2O2能力顯著強于西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖(P<0.05)。

a-還原力；b-Fe2+金屬螯合能力；c-H2O2清除能力圖2 秦巴山區(qū)黑木耳多糖體外抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activities of A.auricula polysaccharides from northwest Qinba Mountain

活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能,在較高濃度時,東北黑木耳多糖的抗氧化能力強于西北黑木耳多糖,可能是由于東北黑木耳多糖具有較高的結(jié)合蛋白和半乳糖能力；兩產(chǎn)地黑木耳多糖結(jié)構(gòu)解析及構(gòu)效關(guān)系尚有待進一步分析研究。

2.3 不同提取方式對西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖理化性質(zhì)的影響

采用不同方法提取得到的植物多糖混合物可能具有不同組分并具有不同生物活性。西北秦巴山區(qū)黑木耳分別經(jīng)熱水提取、酶法提取、超聲提取,凍干所得黑木耳多糖均呈灰褐色絮狀,得率分別為5.40%、3.73%和3.00%。

不同提取方式對秦巴山區(qū)黑木耳多糖糖含量、蛋白含量及糖醛酸含量的影響如表3所示。酶法提取與超聲提取得到的黑木耳粗多糖的總糖含量分別為(64.50±4.52)%、(66.18±2.62)%,兩者間無明顯差異,且均顯著高于熱水提取法(P<0.05)。與總糖含量結(jié)果類似,熱水提取法制得的黑木耳粗多糖蛋白含量最低,酶法提取與超聲提取得到的黑木耳粗多糖的蛋白含量分別為熱水提取法的3.02倍、2.98倍。

表3 不同提取方式對秦巴山區(qū)黑木耳多糖糖含量、蛋白含量及糖醛酸含量的影響 單位：%

3種方法所得黑木耳粗多糖糖醛酸含量均具有顯著性差異(P<0.05),糖醛酸含量排序依次為：熱水提取>超聲提取>酶法提取。

由圖3可知,3種方法制得的黑木耳粗多糖的HPGPC圖譜峰形無對稱性,即制得的黑木耳粗多糖均為非均一性多糖,且分子質(zhì)量均>270 kDa,其中超聲提取制得的多糖組分分子質(zhì)量段范圍更窄,熱水提取的多糖組分有3個顯著的峰。

圖3 不同提取方式制備秦巴山區(qū)黑木耳多糖的HPGPC色譜圖Fig.3 HPGPC chromatogram of Qinba Mountain A.auricula polysaccharides extracted by different methods

由圖4和表4所示,3種方法提取的秦巴山區(qū)黑木耳粗多糖均含巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸6種單糖,以甘露糖為主要成分。

圖4 不同提取方式制得秦巴山區(qū)黑木耳多糖的單糖組成氣相色譜圖Fig.4 Monosaccharide composition GC chromatogram of Qinba Mountain A.auricula polysaccharides extracted by different methods

表4 不同提取方式制得秦巴山區(qū)黑木耳多糖的單糖組成相對摩爾百分比 單位：%

熱水提取制得的黑木耳粗多糖甘露糖、葡萄糖醛酸含量最高,巖藻糖含量最低。與熱水提取和超聲提取相比,酶法提取甘露糖含量較低,而葡萄糖、半乳糖含量較高。

2.4 不同提取方式對西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖體外抗氧化活性的影響

如圖5-a所示,在實驗濃度范圍內(nèi)(0.625～10 mg/mL)3種方法提取得到的黑木耳粗多糖均有一定還原能力,且還原力大小與秦巴山區(qū)黑木耳粗多糖的濃度呈正相關(guān)的關(guān)系。在低濃度(≤1.25 mg/mL)時,3種黑木耳粗多糖的還原力有顯著性差異(P<0.05),順序為：超聲提取>酶法提取>熱水提取。在高濃度(≥2.5 mg/mL)時,超聲提取黑木耳粗多糖和酶法提取黑木耳粗多糖的還原力無顯著性差異,但均顯著性高于熱水提取黑木耳粗多糖的還原力(P<0.05)。

如圖5-b所示,3種不同方法提取的秦巴山區(qū)黑木耳多糖均能夠不同程度地螯合Fe2+,在實驗濃度范圍內(nèi)(0.312 5～10 mg/mL),Fe2+螯合率與黑木耳粗多糖的濃度呈正相關(guān)關(guān)系。在低濃度(≤1.25 mg/mL)時,超聲提取黑木耳粗多糖和酶法提取黑木耳粗多糖的Fe2+螯合率無顯著性差異(P>0.05),但均顯著性高于熱水提取黑木耳粗多糖的Fe2+螯合率(P<0.05)。在高濃度(≥2.5 mg/mL)時,3種方法所提黑木耳粗多糖的Fe2+螯合率有顯著性差異(P<0.05),順序為：超聲提取>酶法提取>熱水提取。在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時,熱水提取黑木耳粗多糖、酶法提取黑木耳粗多糖及超聲提取黑木耳粗多糖的Fe2+螯合率分別為35.88%,52.90%,82.07%。

從圖5-c可知,3種方法制得的秦巴山區(qū)黑木耳粗多糖均有較好的H2O2清除能力。在實驗濃度范圍內(nèi),H2O2清除能力與黑木耳粗多糖濃度呈正相關(guān)關(guān)系。在低濃度(≤2 mg/mL)時,超聲提取黑木耳粗多糖和酶法提取黑木耳粗多糖的H2O2清除率無顯著性差異,但均顯著性高于熱水提取(P<0.05)。在高濃度(2.5 mg/mL)時,3種方法所提黑木耳粗多糖的H2O2清除率有顯著性差異(P<0.05)：超聲提取>酶法提取>熱水提取。在實驗濃度2.5 mg/mL時,酶法提取黑木耳粗多糖、超聲提取黑木耳粗多糖的H2O2清除率分別為熱水提取制得黑木耳粗多糖的3.3倍和4.2倍。

單糖組成的不同可能是導致多糖間活性差異的原因之一。除此之外,多糖的抗氧化生物活性與其分子質(zhì)量大小、官能團數(shù)量、糖苷鍵連接方式等密切相關(guān)[28]。高分子質(zhì)量有利于空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,但分子質(zhì)量過大的多糖難以跨越多重細胞膜障礙而進入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學活性[29]。螺旋構(gòu)象的多糖活性較高,而呈無規(guī)則鏈狀構(gòu)象的多糖活性一般較低。王榮琨等[30]推測超聲波輔助提取法可能破壞了多糖與蛋白等雜質(zhì)的連接鍵,從而使多糖結(jié)構(gòu)中更多的活性基團暴露出來,從而提升了粗多糖的純度和抗氧化能力。

a-還原力；b-Fe2+金屬螯合能力；c-H2O2清除能力圖5 不同提取方式制得秦巴山區(qū)黑木耳多糖的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activities of Qinba Mountain A.auricula polysaccharides extracted by different methods

3 結(jié)論

采用熱水浸提法提取西北秦巴山區(qū)黑木耳多糖,發(fā)現(xiàn)其主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖組成,相對摩爾百分比為60.87∶20.83∶9.86,其多糖結(jié)合蛋白含量及半乳糖比例顯著低于東北黑木耳多糖。秦巴山區(qū)黑木耳多糖具有較好的H2O2清除能力、金屬螯合能力和還原力。低濃度范圍內(nèi),西北黑木耳多糖的抗氧化能力顯著強于東北黑木耳多糖,而在較高濃度范圍時,東北黑木耳多糖的抗氧化能力強于西北黑木耳多糖。不同提取方法制得的秦巴山區(qū)黑木耳多糖均具有較好的抗氧化活性,活性強弱依次為：超聲提取>酶法提取>熱水提取。超聲提取制得的黑木耳多糖糖含量、蛋白含量顯著高于熱水提取；熱水提取制得的黑木耳粗多糖甘露糖、葡萄糖醛酸含量最高,巖藻糖含量最低。