鄧玥,柳天一,陳旭升*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一種由25～35個L-賴氨酸單體,在ε-PL合成酶催化下通過ε-氨基和α-羧基脫水縮合連接而成的同型氨基酸聚合物[1],具有廣譜的抑菌活性和優(yōu)良應(yīng)用屬性,現(xiàn)已被多個國家批準作為生物防腐劑在食品、化妝品防腐等領(lǐng)域應(yīng)用[2-4]。近年來,在醫(yī)藥、生物制藥和農(nóng)業(yè)等行業(yè)中也顯示出應(yīng)用潛力[5-7]。因此,ε-PL具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

微生物發(fā)酵法是目前工業(yè)生產(chǎn)ε-PL的唯一方式,提升發(fā)酵水平以降低其生產(chǎn)成本是實現(xiàn)ε-PL廣泛應(yīng)用的重要前提。因此,研究者們試圖通過菌株選育和發(fā)酵過程優(yōu)化來提高生產(chǎn)菌的ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量。相比于菌株選育,發(fā)酵過程優(yōu)化與調(diào)控是一種簡單、快速提高產(chǎn)物發(fā)酵水平的有效手段。在ε-PL發(fā)酵優(yōu)化和調(diào)控研究方面,KAHAR等[8]建立了兩階段pH值控制策略,結(jié)合葡萄糖和硫酸銨流加工藝,實現(xiàn)StreptomycesalbulusS410的ε-PL產(chǎn)量達到48.3 g/L,長期處于國際領(lǐng)先水平。ZHANG等[9]采用絲瓜囊作為細胞固定化載體,建立了攪拌式發(fā)酵罐Kitasatosporasp.MY 5-36重復(fù)批次發(fā)酵工藝,ε-PL平均產(chǎn)量達到34.11 g/L,固定化細胞重復(fù)利用5次,發(fā)酵周期達到526 h。LIU等[10]利用弱酸性陽離子樹脂D152進行ε-PL原位產(chǎn)物分離發(fā)酵的嘗試,在5 L發(fā)酵罐中進行192 h補料分批發(fā)酵,ε-PL質(zhì)量濃度達到23.4 g/L,較游離菌體發(fā)酵ε-PL產(chǎn)量提高了6.2倍。作者所在實驗室提出了一種pH沖擊發(fā)酵策略,經(jīng)過192 h補料分批發(fā)酵,可實現(xiàn)S.albulusM-Z18發(fā)酵甘油和葡萄糖生產(chǎn)ε-PL的產(chǎn)量分別達到54.7和47.13 g/L[11-12],幫助我國ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量邁入國際先進行列。由此可見,通過優(yōu)化菌體發(fā)酵方式和調(diào)控pH值能夠有效提升ε-PL發(fā)酵水平。

前期,本實驗室通過長期的菌株選育,獲得了1株ε-PL高產(chǎn)突變株S.albulusGS114,其搖瓶ε-PL產(chǎn)量較出發(fā)菌株S.albulusM-Z18提高了70%左右。然而,采用已有的培養(yǎng)條件和發(fā)酵控制策略,S.albulusGS114的ε-PL產(chǎn)量較出發(fā)菌株僅能提高13%左右[13]。如何建立針對性的發(fā)酵調(diào)控策略是發(fā)揮高產(chǎn)菌株生產(chǎn)潛能的關(guān)鍵。因此,本文通過調(diào)節(jié)pH值的方式來調(diào)控發(fā)酵中后期溶氧水平,以期提高S.albulusGS114的ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量,并從氧化損傷角度,初步解析該策略提高ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

StreptomycesalbulusGS114,實驗室選育和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(BTN)(g/L)：葡萄糖10,酵母粉1,魚粉蛋白胨2,pH 7.5。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30,酵母粉8,(NH4)2SO45,KH2PO41.36,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4·7H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.03,pH 7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖90,酵母粉8,(NH4)2SO45,KH2PO41.36,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4·7H2O 0.04,FeSO4·7H2O 0.03,pH 6.8。

1.1.3 試劑和儀器

葡萄糖,優(yōu)級純,山東西王藥業(yè)有限公司；酵母粉,Oxide公司；其他試劑分析純,國藥化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)檢測試劑盒,蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

5 L發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備有限公司；T&J-Miniskid 1 L*4迷你平行生物反應(yīng)器,迪比爾生物工程(上海)有限公司；UV-2100分光光度計,優(yōu)尼科儀器有限公司；AB204-N分析天平,瑞士梅特勒公司；恒溫培養(yǎng)箱GNP-9160,上海光都儀器設(shè)備有限公司；3K15高速冷凍離心機,德國西格瑪公司；Enspire多標(biāo)記檢測系統(tǒng)(酶標(biāo)儀),珀金埃爾默有限公司；biotek多功能酶標(biāo)儀,美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取2～3環(huán)孢子接種至種子培養(yǎng)基,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

不同pH條件的分批發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液以體積分數(shù)8%接種量接入,裝液量為600 mL,溫度設(shè)置為30 ℃,初始轉(zhuǎn)速為200 r/min,溶氧設(shè)置為30%,轉(zhuǎn)速溶氧聯(lián)動控制。待pH分別自然下降至3.5、4.0、4.5和5.0時,用體積分數(shù)12.5%的NH3·H2O分別維持pH恒定直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.2 分析方法

活性氧(reactive oxygen species,ROS)測定：采用熒光探針2,7-二氯熒光雙乙酸鹽(2,7-dichlorofluorescent diacetate,DCFH-DA)測定,方法為：取80 μL發(fā)酵液置于1.5 mL離心管中,加入920 mL磷酸緩沖液進行稀釋懸浮后,再加入濃度為10 mmol/L的DCFH-DA 1 μL,充分混勻后置于30 ℃,200 r/min搖床中,反應(yīng)40 min。12 000 r/min離心5 min,棄上清液,收集菌體,加入磷酸緩沖液12 000 r/min離心5 min洗滌4次,棄上清液,再加800 μL磷酸緩沖液重懸菌體,吸取200 μL于酶標(biāo)孔中,在502、530 nm下檢測熒光強度,并通過蛋白濃度將其定量。根據(jù)熒光強度的大小即可反映胞內(nèi)ROS的水平。

氧化損傷指標(biāo)測定：丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量參考ZENG等[17]的方法。

羰基含量測定參考段麗菊等[18]的方法。

抗氧化體系測定：SOD、CAT和T-AOC按照試劑盒說明進行操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于動態(tài)pH值調(diào)控溶氧水平策略發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的過程參數(shù)分析

低pH值沖擊工藝是本實驗室在優(yōu)化S.albulusM-Z18發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL時,建立的一種高效發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的控制策略。將該調(diào)控策略用于S.albulusGS114發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL時(圖1-a),可實現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量達到44.1 g/L,菌體量為38.99 g/L。相比于S.albulusM-Z18發(fā)酵結(jié)果,ε-PL產(chǎn)量提高了16%,但菌體量卻下降了24.4%,顯示出S.albulusGS114具有較高的單位菌體ε-PL合成能力。S.albulusGS114是經(jīng)過基因組重排和核糖體工程連續(xù)選育,獲得的1株高產(chǎn)ε-PL突變株,其搖瓶ε-PL產(chǎn)量達到3.0 g/L,較出發(fā)菌S.albulusM-Z18提高了1.7倍。然而,S.albulusGS114作為二代菌株,在5 L發(fā)酵罐中ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量僅較一代菌株S.albulusM-Z18提高了10%左右,顯示出S.albulusGS114仍有產(chǎn)量提升空間。如圖1-a所示,利用低pH沖擊工藝,可以實現(xiàn)S.albulusGS114產(chǎn)量達到44.1 g/L,菌體量為(38.99±3.83)g/L。另外,從發(fā)酵過程溶氧變化趨勢來看,從36 h開始溶氧水平逐漸上升,到96 h時溶氧水平達到70%并一直維持至發(fā)酵結(jié)束,意味著在發(fā)酵過程中S.albulusGS114出現(xiàn)了明顯菌體活力下降。因此,我們試圖通過提升菌體活力達到增加菌體量的目的,以進一步提高ε-PL產(chǎn)量。

為此,本研究通過發(fā)酵中后期動態(tài)調(diào)節(jié)pH值來控制發(fā)酵過程溶氧水平保持在20%～40%,從而建立了一種基于動態(tài)pH值調(diào)節(jié)溶氧水平的發(fā)酵控制策略,發(fā)酵過程參數(shù)如圖1-b所示。采用動態(tài)pH值調(diào)節(jié)溶氧水平的發(fā)酵控制策略,在48 h時適當(dāng)提高pH值,隨后溶氧在60 h左右開始下降；當(dāng)溶氧水平低于20%時,再適當(dāng)下調(diào)pH值,如此反復(fù),實現(xiàn)發(fā)酵過程溶氧水平維持在20%～40%。經(jīng)過192 h補料分批發(fā)酵,DCW達到62.03 g/L,ε-PL產(chǎn)量達到(60.2±0.94)g/L,分別比未調(diào)控提高了59%和36%。由此可見,基于動態(tài)pH值調(diào)節(jié)溶氧水平的發(fā)酵控制策略,不僅能夠顯著改善S.albulusGS114生長狀況,而且能夠明顯提高其ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量,實現(xiàn)二代菌株S.albulusGS114發(fā)酵產(chǎn)量的進一步提高,對提升工業(yè)發(fā)酵ε-PL水平具有重要指導(dǎo)意義。

a-pH沖擊策略；b-pH調(diào)控策略圖1 不同策略發(fā)酵過程中各指標(biāo)變化Fig.1 Indices under different strategies during fermentation

2.2 動態(tài)pH值調(diào)控溶氧水平發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL過程的氧化損傷相關(guān)參數(shù)分析

2.2.1 ROS水平及氧化損傷分析

a-ROS；b-MDA；c-羰基含量圖2 發(fā)酵過程中的氧化損傷參數(shù)比較Fig.2 Comparison of oxidation damage parameters during fermentation

分別以脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA(圖2-b)和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物羰基(圖2-c)的含量作為氧化損傷指標(biāo)來評估ROS對菌體帶來的氧化損傷。如圖2-b所示,MDA含量隨著發(fā)酵進行而逐漸上升,在整個發(fā)酵過程中pH調(diào)控組始終略高于pH沖擊組,這也符合高ROS水平會給菌體帶來更高氧化損傷的一般認知。然而,如圖2-c所示,2組的羰基含量幾乎處于同一水平,直到發(fā)酵結(jié)束時才出現(xiàn)差異。這可能因為小白鏈霉菌的呼吸鏈位于細胞膜上,呼吸作用產(chǎn)生的ROS首先對膜脂質(zhì)進行攻擊,同時膜脂質(zhì)的氧化增加了電子泄露的可能[21],導(dǎo)致更高的ROS水平。

以上結(jié)果說明,隨著發(fā)酵的進行S.albulusGS114受到的氧化損傷程度逐漸增加,但是更高的ROS水平并未帶來更高的氧化損傷。這可能是因為通過pH調(diào)控策略使得菌體的活力增強,即使在ROS水平較高的情況下也能夠通過激活抗氧化系統(tǒng)來保護自身免受氧化脅迫的危害。

2.2.2 抗氧化能力分析

a-CAT；b-SOD；c-T-AOC圖3 發(fā)酵過程中抗氧化能力參數(shù)比較Fig.3 Comparison of antioxidant capacity parameters during fermentation

2.3 pH值對ε-PL發(fā)酵過程中氧化損傷相關(guān)參數(shù)影響的分析

為了探究動態(tài)pH值調(diào)控溶氧發(fā)酵過程中,ROS水平升高和菌體抗氧化能力提高的原因,本研究分別考察了S.albulusGS114在pH 3.5、4.0、4.5和5.0的ROS水平和菌體T-AOC。如圖4-a所示,pH值越高DCW越大,在pH 5.0發(fā)酵條件下,菌體生長情況最好；而在pH 3.5時,DCW在36 h達到最大之后開始逐漸下降,表明S.albulusGS114在此pH值下不適宜生長。圖4-b顯示的是不同pH值下菌體細胞內(nèi)的ROS水平。pH值越高,ROS水平越高,除pH 3.5外,ROS在12～24 h激增,在24～48 h波動不大,48 h后迅速增加,整體上呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定再上升的趨勢。這可能是由于在較高的pH下,菌體生長狀態(tài)較好,其呼吸活力較強,產(chǎn)生的ROS水平就越高,這個結(jié)果與pH調(diào)控組的ROS水平較高相吻合(圖3-a)。圖4-c顯示的是對不同pH下S.albulusGS114胞內(nèi)的總抗氧化能力進行了比較。菌體總抗氧化能力與發(fā)酵pH值高地成正比,pH 3.5時抗氧化能力明顯低于其他3組,這也與其菌體生長情況相吻合,表明較低的pH不僅抑制了S.albulusGS114的正常生長,也抑制了其胞內(nèi)各種代謝的正常進行。通過考察不同pH條件下S.albulusGS114的ROS水平和T-AOC發(fā)現(xiàn),pH值越高ROS水平越高,在pH 4.0與4.5時,隨著發(fā)酵時間的增加,ROS水平的差異逐漸增大,由于pH調(diào)控策略在發(fā)酵過程中有較長的一段時間需要將pH提升至4.0以上,因此在pH調(diào)控的發(fā)酵過程中ROS一直處于較高的水平；菌體的總抗氧化能力也與發(fā)酵pH值成正比,這可能是由于pH越高,S.albulusGS114生長狀態(tài)越好,呼吸活力的增強帶來了更多的ROS,從而激活胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),使得自身的總抗氧化能力得到增強。

a-DCW；b-ROS；c-T-AOC圖4 不同pH發(fā)酵的菌體量、ROS水平和抗氧化能力比較Fig.4 Comparison of biomass,ROS level and T-AOC during fermentation with different pH

3 結(jié)論

為了提高S.albulusGS114的ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量,本文通過在發(fā)酵中后期動態(tài)調(diào)節(jié)pH值來控制發(fā)酵過程溶氧水平在20%～40%,建立了一種基于動態(tài)pH值調(diào)節(jié)溶氧水平的發(fā)酵控制策略,ε-PL產(chǎn)量達到(60.2±0.94)g/L,較未調(diào)控發(fā)酵提高了36%。通過氧化損傷相關(guān)參數(shù)分析,初步揭示了動態(tài)pH值調(diào)節(jié)溶氧水平提高ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量的原因：動態(tài)調(diào)節(jié)pH值策略顯著增強了發(fā)酵中后期菌體生長能力和總抗氧化能力(包括過氧化氫酶活性),以維持菌體胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平維持在菌體可以承受的范圍,促進了ε-PL在發(fā)酵中后期的生物合成。很多研究都已表明ROS具有調(diào)節(jié)次級代謝產(chǎn)物的作用[22-24],本研究結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)了ROS對促進ε-PL生物合成的潛在作用,因此下一步將考察ROS是否直接調(diào)節(jié)聚賴氨酸的合成,為提升工業(yè)發(fā)酵ε-PL水平提出進一步指導(dǎo)。