武淑娟,贠建民,王睿,何奎,毛永強(qiáng),趙風(fēng)云,張紊瑋,艾對(duì)元

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)

粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)是引起果蔬采后病害的重要病原物[1],它不僅能夠侵染果蔬產(chǎn)品,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而且產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物單端孢霉烯毒素具有生物毒性[2]。目前,控制由T.roseum引起的果蔬采后病害主要依賴(lài)于化學(xué)合成的殺真菌劑[3],但是化學(xué)合成殺菌劑的長(zhǎng)期使用,易引起藥物殘留,污染環(huán)境并影響人類(lèi)健康,甚至增加病原體的抗藥性[4]。因此,選擇替代或減少化學(xué)合成殺菌劑,研究相應(yīng)的抑菌物質(zhì)具有重大意義[5]。

抗菌肽又名抗微生物肽[6],是一類(lèi)小分子的多肽類(lèi)物質(zhì),具有抗真菌的生物學(xué)特性且不易產(chǎn)生耐藥性,有望成為化學(xué)藥物替代品,應(yīng)用潛力和價(jià)值巨大[7]。實(shí)驗(yàn)室前期從腐敗的濕粉條中分離得到了1株對(duì)粉紅單端孢具有拮抗作用的芽孢桿菌,經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) HN-10,利用B.pumilusHN-10發(fā)酵液開(kāi)展了拮抗實(shí)驗(yàn)研究[8]；嚴(yán)海嬌等[9-10]通過(guò)硫酸銨沉淀、AB-8大孔吸附樹(shù)脂、Sephadex G-100凝膠和半制備型反相高效液相色譜法對(duì)B.pumilusHN-10發(fā)酵液進(jìn)行逐級(jí)分離純化,獲得了抗真菌肽P-1,并證實(shí)了B.pumilusHN-10抗菌肽P-1僅對(duì)粉紅單端孢具有抑菌作用;明確了其氨基酸序列和分子質(zhì)量,分別是GGSGGGSSGGSIGGR和1 149.14 Da；郭娟等[11]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)初步分析了抗菌肽P-1對(duì)粉紅單端孢胞內(nèi)核酸,以及蛋白質(zhì)的影響,但尚未明確其抑菌機(jī)理。

本試驗(yàn)以粉紅單端孢為供試菌,基于平板培養(yǎng)和液態(tài)培養(yǎng)體系,采用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色和透射電鏡技術(shù)觀察、結(jié)合系列生理生化指標(biāo)測(cè)定,從細(xì)胞壁、膜結(jié)構(gòu)變化、膜通透性以及膜脂過(guò)氧化等方面,探討B(tài).pumilusHN-10抗菌肽P-1處理對(duì)粉紅單端孢細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)代謝的影響,以期闡明抗菌肽P-1的抑制作用機(jī)理,為紅粉病害控制及新型生防治劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料：抗菌肽P-1,分離純化于短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) HN-10。

試驗(yàn)菌株：粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)CICC 2703,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1B.pumilusHN-10抗菌肽P-1的粗提和分離純化

參照嚴(yán)海嬌等[9]的方法測(cè)定。

1.2.2T.roseum孢子懸浮液制備

參照劉志恬等[12]的方法制備。

1.2.3 抗菌肽P-1抑菌效果的測(cè)定

采用牛津杯法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。在PDA平板中央滴1滴(約2 μL),1×108個(gè)/mL的T.roseum孢子懸浮液,然后在孢子懸浮液等距2 cm處放置4個(gè)牛津杯,吸取抗菌肽P-1 1 μL滴加于牛津杯中,等量無(wú)菌蒸餾水做為空白對(duì)照,置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,采用十字交叉法測(cè)定抑菌直徑。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum孢子細(xì)胞膜完整性和超微結(jié)構(gòu)的影響

細(xì)胞膜完整性采用PI染色檢測(cè),具體參照WANG等[13]的方法測(cè)定,其超微結(jié)構(gòu)變化參照HELAL等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum菌體生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在150 mL PDA 液體培養(yǎng)基中接種120 μL密度為1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液和1 μg/mL的抗菌肽P-1,28 ℃,200 r/min 培養(yǎng)0、1、3、5、7 d,10 000 r/min離心20 min分別收集菌絲,80 ℃ 烘干至恒重,稱(chēng)量質(zhì)量。每組重復(fù)3次。

1.2.6 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum菌體細(xì)胞膜上麥角甾醇含量的影響

參考LIU等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞外膜通透性參照付永巖等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定；電導(dǎo)率參照王雪燕等[17]的方法；脂質(zhì)過(guò)氧化參照PUSHPANATHAN等[18]的方法；蛋白羰基化參照段麗菊等[19]的方法；丙二醛(malondialdehyole,MDA)含量參照王霆等[20]的方法。

1.2.8 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum菌體活性氧代謝的影響

1.3 數(shù)據(jù)分析和處理

全部數(shù)據(jù)用Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,使用Origin 9.0軟件作圖。用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析及相關(guān)性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.pumilus HN-10抗菌肽P-1的純化

由表1可知,B.pumilusHN-10抗菌肽P-1經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀、AB-8大孔吸附樹(shù)脂、Sephadex G-100凝膠進(jìn)行了分級(jí)純化,最終得到了抗菌肽P-1。結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)逐級(jí)純化的抗菌肽P-1對(duì)粉紅單端孢具有明顯的抑菌作用。

表1 不同純化方式對(duì)粉紅單端孢的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of different purification methods against T.roseum

2.2 抗菌肽P-1抑菌效果的測(cè)定

抗菌肽P-1對(duì)T.roseum的抑菌作用如圖1,抗菌肽P-1對(duì)粉紅單端孢菌體生長(zhǎng)具有明顯抑制作用,抑菌圈直徑達(dá)到(12.1±0.10) mm。

1-加入抗菌肽P-1；CK-對(duì)照?qǐng)D1 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of antifungal peptide P-1 on T.roseum

2.3 PI檢測(cè)抗菌肽P-1對(duì)T.roseum孢子細(xì)胞膜完整性的影響

PI為非膜滲透性熒光染料,可以染色細(xì)胞核,質(zhì)膜完整的細(xì)胞中,PI無(wú)法正常進(jìn)入細(xì)胞,因而可以利用這一性質(zhì)觀察細(xì)胞核是否被染色,若能觀察到熒光則證明質(zhì)膜不完整。在熒光顯微鏡下觀察,正常的細(xì)胞不能被染上紅色,只有細(xì)胞膜被破壞的細(xì)胞才能發(fā)出紅色熒光,并且早期凋亡的細(xì)胞紅光比較微弱,晚期凋亡的細(xì)胞紅光變強(qiáng)[22]。由圖2可知,處理組中隨著抗菌肽P-1時(shí)間的延長(zhǎng),被PI染色的孢子數(shù)逐漸增多(圖2-d～圖2-f),處理組可觀察到明顯熒光,而對(duì)照組(圖2-a～圖2-c)幾乎無(wú)熒光。由此說(shuō)明抗菌肽P-1破壞了T.roseum孢子的細(xì)胞膜完整性。

a-對(duì)照4 h；b-對(duì)照8 h；c-對(duì)照-12 h；d-處理4 h；e-處理8 h；f-處理12 h圖2 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum孢子質(zhì)膜完整性的影響Fig.2 Effect of antifungal peptide P-1 on plasma membrane integrity of T.roseum spores

2.4 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum孢子超微結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗菌肽P-1對(duì)T.roseum孢子的破壞作用,通過(guò)透射電鏡觀察正常菌體及被抗菌肽P-1處理的菌體細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞壁、膜及細(xì)胞器的變化情況,從細(xì)胞水平分析抗菌肽P-1對(duì)菌體的影響[23]。對(duì)照組孢子結(jié)構(gòu)完整且緊密,壁、膜平滑完整,胞內(nèi)橫隔膜完整且細(xì)胞器分布均勻(圖3-a)。抗菌肽P-1處理4 h后,有些菌體壁、膜邊緣變得粗糙不平,甚至出現(xiàn)局部的破損缺口(圖3-b)。處理8 h時(shí),菌體內(nèi)橫隔膜內(nèi)陷斷裂細(xì)胞壁薄厚不均甚至殘缺,細(xì)胞質(zhì)外滲出現(xiàn)電子密度高的陰影,細(xì)胞器分布紊亂(圖3-c)。延長(zhǎng)處理時(shí)間至12 h時(shí),觀察到細(xì)胞器不規(guī)則且模糊,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物大多消失,細(xì)胞質(zhì)大量外滲,孢子變形(圖3-d)。由此可知,抗菌肽P-1處理破壞了T.roseum菌體的超微結(jié)構(gòu),且處理時(shí)間越長(zhǎng),破壞越嚴(yán)重。

Cw-細(xì)胞壁;Cm-細(xì)胞膜;Cy-細(xì)胞質(zhì)a-對(duì)照0 h(×18 000)；b-處理4 h(×25 000)；c-處理8 h(×21 000)；d-處理12 h(×21 000)圖3 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum孢子超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of antifungal peptide P-1 on ultrastructure of T.roseum spores注：a-×18 000；b-×25 000；c、d-×21 000

2.5 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum菌體生物量和細(xì)胞膜麥角甾醇含量的影響

菌體生物量如圖4-a,對(duì)照組的T.roseum生長(zhǎng)良好,具有典型微生物的生長(zhǎng)曲線特征,在第5天進(jìn)入穩(wěn)定期,第7天時(shí)達(dá)到最大生物量為0.171 g。而處理組生長(zhǎng)曲線位于對(duì)照組下方,生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)為平緩的下降趨勢(shì)。結(jié)果說(shuō)明抗菌肽P-1能夠明顯抑制T.roseum的生長(zhǎng)繁殖。

麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組分,主要以自由態(tài)的形式存在于磷脂雙分子層中,在維持細(xì)胞膜流動(dòng)性方面起著重要的作用[24]。麥角甾醇的缺失或降低,會(huì)導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞及功能的喪失[25]。因此,麥角甾醇含量的變化是衡量細(xì)胞膜受損的主要指標(biāo)。由圖4-b可知,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),麥角甾醇含量呈下降趨勢(shì),且在每個(gè)時(shí)段,處理組的麥角甾醇含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),第7天時(shí),相比對(duì)照組,減少了35%(P<0.05)。結(jié)果表明,抗菌肽P-1可以有效抑制T.roseum麥角甾醇的合成,引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受損,從而達(dá)到抑菌作用。

a-T.roseum菌體生物量；b-麥角甾醇含量圖4 抗菌肽P-1處理對(duì)T.roseum菌體生物量和麥角甾醇含量的影響Fig.4 Effects of antifungal peptide P-1 treatment on T.roseum biomass and ergosterol content注：豎線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SD),*代表組內(nèi)差異顯著(P<0.05)(下同)

2.6 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum細(xì)胞膜通透性的影響

2.6.1 熒光染料N-苯基-1-萘胺攝取率的測(cè)定結(jié)果

N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,NPN)是一種疏水熒光探針,在水環(huán)境中不會(huì)發(fā)出熒光,但在疏水環(huán)境中會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光[26]。因此可以利用熒光染料NPN來(lái)評(píng)價(jià)抗菌肽P-1通過(guò)T.roseum細(xì)胞外膜的能力。圖5反映了T.roseum胞內(nèi)熒光NPN攝取率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況。結(jié)果顯示,在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),NPN攝取率呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì),且在每個(gè)時(shí)段,處理組的NPN攝取率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在第7天時(shí),其高出對(duì)照組24%(P<0.05),說(shuō)明抗菌肽P-1處理可造成T.roseum細(xì)胞外膜通透性增大,使NPN與膜上的磷脂分子中的疏水基結(jié)合,產(chǎn)生熒光。

圖5 抗菌肽P-1處理對(duì)T.roseum菌體NPN熒光吸收強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on NPN fluorescence absorption intensity of T.roseum cells

2.6.2 電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果

電導(dǎo)率的變化可反映細(xì)胞膜滲透性的改變[27]。圖6顯示,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,處理組菌體細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率明顯高于對(duì)照組,在第7天,比對(duì)照組高35%(P<0.05),表明抗菌肽P-1處理使T.roseum細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生改變,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的調(diào)節(jié)能力下降,使細(xì)胞失水或脹破,從而起到抑菌作用。

圖6 抗菌肽P-1處理對(duì)T.roseum菌體相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.6 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on relative conductivity of T.roseum cells

2.7 抗菌肽P-1對(duì)T.roseum菌體活性氧代謝的影響

圖7 P-1處理對(duì)T.roseum菌體的影響Fig.7 Effect of P-1 treatment on superoxide anion of T.roseum

2.7.2 對(duì)抗氧化酶系(SOD、CAT、POD)和H2O2含量的影響

圖8反映了P-1處理對(duì)參與ROS反應(yīng)的相關(guān)抗氧化酶系活力和H2O2含量的影響。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),SOD活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì),第1、3天,處理組的SOD活性都顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖8-a)；CAT活性呈先增大后減小的趨勢(shì),處理組的CAT活性顯著高于對(duì)照(P<0.05)(圖8-b)；POD整體呈現(xiàn)增大的趨勢(shì),且處理組的POD活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖8-c)；H2O2含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),且處理組的H2O2的含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖8-d)。結(jié)果表明抗菌肽P-1處理加劇了T.roseum胞內(nèi)的抗氧化程度。

a-SOD活力；b-CAT活力；c-POD活力；d-H2O2含量圖8 抗菌肽P-1處理對(duì)T.roseum 菌體SOD活力、CAT活力、POD活力及H2O2含量的影響Fig.8 Effect of antifungal peptide P-1 on SOD,CAT,POD activity and the content of H2O2 in T.roseum

2.7.3 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白羰基化的影響

脂質(zhì)和蛋白是細(xì)胞膜的主要組成部分,由ROS大量積累引起的脂質(zhì)和蛋白的氧化損傷,可直接影響T.roseum的正常生理活動(dòng)。由圖9可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),處理組的脂質(zhì)過(guò)氧化值(OD535)高于對(duì)照組,第7天時(shí),OD535高于對(duì)照組55%(P<0.05)(圖9-a)；處理組蛋白羰基含量顯著高于對(duì)照組。第7天時(shí),羰基含量高于對(duì)照組71.96%(P<0.05)(圖9-b)。上述結(jié)果表明抗菌肽P-1處理使T.roseum細(xì)胞膜氧化損傷引起的脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白羰基化程度加深。

a-T.roseum菌體OD535；b-羰基含量圖9 抗菌肽P-1處理對(duì)T.roseum菌體OD535和羰基含量的影響Fig.9 Effect of P-1 treatment on OD535 and carbonyl content of T.roseum

2.7.4 對(duì)MDA含量的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化作用的主要產(chǎn)物之一,一般利用其含量作為膜脂過(guò)氧化的指標(biāo),反映細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[28]。由圖10可知,處理組MDA含量顯著高于對(duì)照組,第7天時(shí),MDA含量比對(duì)照組高67.6%(P<0.05)。表明抗菌肽P-1處理使菌體發(fā)生膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),引起菌體MDA含量升高,最終導(dǎo)致細(xì)胞膜受損。

圖10 抗菌肽P-1處理對(duì)T.roseum菌體MDA含量的影響Fig.10 Effect of antifungal peptide P-1 treatment on MDA content of T.roseum

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜通透性及ROS代謝3個(gè)方面研究了抗菌肽P-1處理對(duì)T.roseum有抑菌作用。液體培養(yǎng)結(jié)果顯示,抗菌肽P-1處理能夠明顯抑制T.roseum菌體生物量的增加,通過(guò)超微觀察發(fā)現(xiàn)P-1破壞了T.roseum孢子的細(xì)胞壁膜、局部出現(xiàn)了缺口、細(xì)胞質(zhì)大量流出,致使孢子的形態(tài)發(fā)生了劇烈的變化,胞質(zhì)變得不均勻。這可能是抗菌肽P-1抑制T.roseum菌體生長(zhǎng)的主要原因[29]。

細(xì)胞膜是主要由磷脂構(gòu)成的富有彈性的半透性膜,麥角甾醇可以與磷脂結(jié)合形成穩(wěn)定磷脂相,進(jìn)而增加細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[30]。本研究結(jié)果顯示,抗菌肽P-1處理使T.roseum細(xì)胞膜上麥角甾醇含量減少,可能是由于抗菌肽P-1抑制了麥角甾醇的生物合成途徑,使膜的結(jié)構(gòu)和完整性受到影響,使NPN這種對(duì)細(xì)胞外膜敏感性熒光染料透過(guò)了細(xì)胞外膜,與膜上的磷脂雙分子層中的疏水基產(chǎn)生了結(jié)合；同時(shí),抗菌肽P-1處理后T.roseum菌體細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率的不斷增大,進(jìn)一步證明抗菌肽P-1處理破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),改變了膜的穩(wěn)定性。

本研究從超微結(jié)構(gòu)、膜通透性以及ROS代謝的研究中推測(cè)出抗菌肽P-1對(duì)粉紅單端孢的抑菌機(jī)理可能是通過(guò)破壞T.roseum菌體膜的完整性,改變膜的通透性,以及誘導(dǎo)ROS在胞內(nèi)的積累,引起氧化脅迫反應(yīng),從而導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失,菌體生長(zhǎng)受到抑制。