吳蘭 劉陽 張雯翔 王琛 劉暢

摘要 在現(xiàn)代社會中，食品添加劑在食品工業(yè)的生存和發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。作為食品添加劑家族的重要一員，2，3-丁二酮（2，3-butanedione，BUT）被廣泛用于制造牛奶香精。然而為了降低成本，生產(chǎn)商使用BUT作為原料，對食品的安全性構(gòu)成了極大的威脅。近年來，已發(fā)現(xiàn)BUT可引起肺部閉塞性細(xì)支氣管炎，但BUT對肝臟是否具有潛在毒性仍然未知。本研究使用L02細(xì)胞作為體外模型，檢測細(xì)胞暴露于BUT 12 h是否會引起肝毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)BUT的劑量達(dá)到0.5 mM時，肝細(xì)胞活性顯著降低，出現(xiàn)大量死細(xì)胞，細(xì)胞活性氧增加并且線粒體膜電位降低，Capase-3活性顯著升高，Nf-κB和Caspase-3基因與蛋白表達(dá)量均升高。這些結(jié)果表明，當(dāng)BUT濃度達(dá)到一定的劑量閾值時，可以引起一定程度的肝細(xì)胞凋亡。

關(guān) 鍵 詞 2，3-丁二酮;L02細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;Nf-κB;Caspase-3

中圖分類號 TQ657.1? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A

Abstract In modern society， food additives play an important role in the survival and development of the food industry. Among which， 2，3-butanedione （BUT） is widely used in the production of milk flavor. In order to reduce costs， manufacture uses the BUT as a raw material， which would pose a great threat to the food safety. In recent years， it has been reported that BUT causes pulmonary bronchiolitis obliterans. However， the potential toxicity of BUT on the liver remains unknown. In the present study， we used an in vitro model of L02 cells to test whether exposure to BUT for 12 h would cause hepatotoxicity. Our results showed that BUT caused an extreme reduction in the hepatocyte viability and massive cell death， increased reactive oxygen species production， decreased mitochondrial membrane potential， significantly increased the activity of Capase-3， and finally elevated Nf-κB and Caspase-3 genes expression. All in all， our results indicate that BUT causes hepatocytes apoptosis when reaching to a certain dose threshold.

Key words 2， 3-butanedione; L02 cells; apoptosis; Nf-κB; Caspase-3

0 引言

在社會經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的今天，食品工業(yè)已取得了長足的進(jìn)步，其中食品添加劑的重要性也日益凸顯[1]。然而，各種食品安全問題也正不斷出現(xiàn)[2]。為減少或避免食品安全問題的發(fā)生，防止其對人體產(chǎn)生不利影響，人們必須采取相應(yīng)措施，減少食品中有害添加劑的使用。隨著中國社會主義市場與計(jì)劃經(jīng)濟(jì)的蓬勃發(fā)展，食品工業(yè)也隨之快速發(fā)展與進(jìn)步，食品中“色”、“香”越來越受到消費(fèi)者的青睞。食品添加劑已成為現(xiàn)代食品中不可或缺的一部分，在改善食品的外觀、顏色和味道方面發(fā)揮著重要作用[3-7]。另一方面，對食品添加劑的非法使用也會引起嚴(yán)重疾病的發(fā)生，如心腦血管疾病、癌癥等[8-9]。目前，世界上已使用了25 000多種食品添加劑（其中80%是香料）[10]。能夠直接被人們使用的約3 000～4 000種，其中600～1 000種食品添加劑為人們所常用。由于每個國家的食品安全控制要求和技術(shù)的差異，其對食品添加劑的可允許使用類型和范圍是不同的。例如，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已發(fā)布了2 922種食品添加劑，其中1 755種得到管理。目前，中國的食品添加劑已達(dá)23類，超過2 000種，主要包括香料，消泡劑，防結(jié)塊劑，增味劑，防腐劑，膨松劑等[10]。

2，3-丁二酮（BUT），也稱為二乙酰，是一種重要的香料，顏色介于黃色和淺綠色之間，具有強(qiáng)烈的奶油香氣[11]。它不僅是乳制品中的重要成分，同時也是奶油、奶酪和其他需要乳白味的非乳制品的重要香料[12]。此外，BUT還可用作明膠[13]的固化劑，攝影用粘合劑[14]，以及藥物[15]，農(nóng)藥[4，16]和其他精細(xì)化學(xué)品[17]的合成中間體。由于其廣泛的應(yīng)用，BUT正在受到越來越多的關(guān)注。除人工添加外，脂類[18]、碳水化合物[19]和維生素等食物成分可通過多種方式形成，如過氧化、氧化分解、美拉德反應(yīng)[20]、光敏氧化[15，21-22]等反應(yīng)。雖然BUT被美國FDA[23]歸類為公認(rèn)安全類添加劑，但其在各個方面的安全性依然需要人們加以重視。目前國內(nèi)外關(guān)于BUT安全性的研究報(bào)告很少，相關(guān)研究也有待加強(qiáng)。

近年來的研究表明，BUT具有閉塞性細(xì)支氣管炎和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等毒性作用[15]。目前，關(guān)于直接食用BUT引起的大鼠急性中毒的報(bào)道尚未確定，但有一些有效的證據(jù)顯示BUT的劑量可能誘發(fā)包括肝臟在內(nèi)的多種器官的損傷[23]。但是，關(guān)于由BUT引起的肝損傷的報(bào)道并不多。因此，選擇BUT來損害正常肝細(xì)胞，以便在細(xì)胞水平上初步發(fā)現(xiàn)BUT對肝臟的損害。希望本文的研究可以為BUT的健康危害提供可靠的理論依據(jù)，并為修訂BUT在食品中應(yīng)用的有限標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

2，3-丁二酮（中國阿拉丁公司）;CCK-8試劑（中國，建成生物工程研究所）;線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、活性氧檢測試劑、Caspase-3活性檢測試劑（中國，碧云天公司）;RPMI-1640培養(yǎng)基（美國，賽默飛公司）;抗體CASPASE-3、NF-κB（美國，Santa Cruz Biotechnology公司）;二抗（美國，Jackson ImmunoResearch公司）;細(xì)胞裂解緩沖液（中國，碧云天公司）;苯基甲基磺酰氟（PMSF，美國，Sigma公司）;BCA蛋白測定試劑盒（中國，碧云天公司）;Trizol 、PrimeSc試劑盒（日本，Takara公司）。

1.2 儀器

GENE SPEED離心機(jī)（中國，基因有限公司）;Tanon EPS 300（中國，天能有限公司）;Tanon 6600發(fā)光成像工作站（中國，天能有限公司）;RT- PCR儀（美國，賽默飛有限公司）;Light Cycle 480II PCR儀（瑞士，羅氏公司）;倒置熒光顯微鏡（日本，Nikon公司）;酶標(biāo)儀（瑞士，TECAN貿(mào)易有限公司）。

1.3 細(xì)胞

人正常肝臟細(xì)胞L02細(xì)胞購買于上海中科院并且長期保存于本實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在包含L-谷氨酰胺，25 mM HEPES緩沖液和碳酸氫鈉的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞L02。該培養(yǎng)基補(bǔ)充有MEM非必需氨基酸（1%）。所有細(xì)胞均補(bǔ)充有10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素，并在37°C下用5%的CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時，采用0.25%胰酶消化傳代。

2.2 CCK-8法

將對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后種植于96孔板中，各給藥濃度細(xì)胞設(shè)置復(fù)孔3孔。待細(xì)胞濃度密度增殖至60%～70%時，分別加入0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mM的BUT培養(yǎng)24 h，將10 μL CCK-8加入96孔板的每個孔中，并在37 °C下孵育2.5 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔的吸光度，并計(jì)算各濃度的平均值，分析并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 BUT處理誘導(dǎo)L02細(xì)胞的形態(tài)變化

細(xì)胞傳代并種植于6孔板后，培養(yǎng)細(xì)胞待密度為60%～70%時，加入不同濃度的BUT，待處理12 h后，用光學(xué)顯微鏡（200×）觀察細(xì)胞后，并拍攝下不同濃度細(xì)胞的狀態(tài)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將BUT處理12 h的細(xì)胞培養(yǎng)基吸入合適的離心管中，用PBS沖洗貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰蛋白酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。加入上述中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，攪拌均勻，移入離心管，1 000g離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸。再次離心重懸的細(xì)胞，5 min 1 000g，棄上層液， 加入195 μL Annexin V-EGFP結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-EGFP，輕輕混勻。再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫（20～25 ℃）避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中。并使用鋁箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2～3次以改善染色效果。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

2.5 線粒體膜電位（MMP）測定

細(xì)胞種植于六孔板在給與BUT刺激12 h后，吸出培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌一次，然后加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液以及1 mL JC-1染色溶液并充分混合。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育20 min。在溫育期間，以每1 mL JC-1染色緩沖液（5×）4 mL蒸餾水的比例制備適量的JC-1染色緩沖液（1×），并置于冰浴中。在37 ℃下溫育后，吸出上清液，并用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌兩次。即加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，其中可能含有血清和酚紅。在倒置熒光顯微鏡下觀察。

2.6 細(xì)胞活性氧（ROS）測定

DCFH-DA用無血清培養(yǎng)基按1∶1 000稀釋至終濃度10 μM。待細(xì)胞接受BUT 12 h刺激后，用適當(dāng)量的含有DCFH-DA的新鮮培養(yǎng)基更新細(xì)胞培養(yǎng)基，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，以充分除去未被細(xì)胞吸收的DCFH-DA。使用488 nm的激發(fā)波長和525 nm的發(fā)射波長，通過熒光酶標(biāo)儀檢測藥物處理后的熒光強(qiáng)度，以測量每種藥物濃度下細(xì)胞活性氧的程度。

2.7 活細(xì)胞Caspase-3活性檢測

細(xì)胞種植于96孔板中，待細(xì)胞密度大約達(dá)到70%時，不同濃度的BUT處理L02細(xì)胞12 h。用含5 μM底物的新鮮培養(yǎng)液或者PBS對細(xì)胞進(jìn)行換液，Ac-DEVD -CHO抑制劑組要補(bǔ)充原來濃度的抑制劑。室溫避光孵育15～30 min。酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長515 nm。記錄數(shù)據(jù)。

2.8 實(shí)時定量PCR（qPCR）

使用 Trizol 法提取總 RNA 后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 1 μg 的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，隨后，使用 SYBR Premix Ex Taq 檢測目的基因的 mRNA 表達(dá)水平，以人β-actin基因?yàn)閮?nèi)參。引物序列如下：

β-actin F：5’-GAAACTGCTGCCTCACATCCG-3’，R：5’-GCTGGCACAGTGACCTCACACG-3’;

NF-κB F：5’-CTACACAGGACCAGGGACAG-3’，R：5’-GCACAGCATTCAGGTCGTAG-3’;

Caspase-3 F：5’-ACTGGACTGTGGCATTGAGA -3’，R：5’-GCACA AAGCGACTGGATGAA-3’ 。

2.9 Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平

RIPA 裂解液冰浴裂解肝細(xì)胞，收集總蛋白。取等量蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入一抗（β-actin以1∶5 000稀釋，和 NF-κB和CASPASE-3以1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次后加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000稀釋），室溫下孵育1 h，使用 PBST 洗滌3次，每次10 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影。

2.10 統(tǒng)計(jì)分析

使用軟件包Origin 8對獲得的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。找到了每個研究參數(shù)的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。兩組之間的比較通過t檢驗(yàn)確定對顯著性結(jié)果進(jìn)行配對檢驗(yàn)。與空白對照組（0 mM）做配對檢驗(yàn)，顯著性水平為*P <0.05，**P<0.01為極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 在體外用BUT直接處理肝細(xì)胞會降低細(xì)胞活力

為了評估BUT是否可以在體外影響肝細(xì)胞的存活力，用劑量從0 mM增加到4.0 mM的BUT劑量處理了L02細(xì)胞12 h。實(shí)驗(yàn)表明，BUT 12 h后，低劑量的BUT對 L02細(xì)胞活力影響較小，當(dāng)濃度增加至0.2 mM時細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著性降低（P <0.05，細(xì)胞活力為87%）（圖1）。與未處理的細(xì)胞相比，在4.0 mM時，細(xì)胞活力約降低至19%（P <0.01）。累積計(jì)算法計(jì)算得到BUT的半數(shù)致死劑量（LD 50）值為2.0 mM。

3.2 細(xì)胞形態(tài)變化

用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間開始失去接觸，隨著BUT濃度的增加而分離。當(dāng)BUT濃度達(dá)到4.0 mM時，發(fā)現(xiàn)健康形態(tài)特征和細(xì)胞完整性完全消失，可以清楚地看到死細(xì)胞。

3.3 BUT誘導(dǎo)L02細(xì)胞凋亡

為了確認(rèn)BUT對人正常肝細(xì)胞凋亡的影響，使用Annexin V-PE / 7-AAD染色和流式細(xì)胞儀對凋亡細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行了定量分析（圖3）?？梢詮膱D3中看出隨著BUT濃度升高細(xì)胞的凋亡率明顯增加。當(dāng)BUT處理濃度達(dá)到0.5 mM時（凋亡率增加至22%），與對照組相比已出現(xiàn)顯著性差異。待濃度達(dá)到2.0 mM，細(xì)胞的凋亡率達(dá)到57%，當(dāng)濃度為4.0 mM時細(xì)胞幾乎全部凋亡（凋亡率為86%）。

3.4 BUT對L02細(xì)胞線粒體毒性的影響

為了更好地了解BUT是如何引起肝細(xì)胞活力降低，首先檢測了細(xì)胞線粒體的完整性。如圖4所示，用JC-1染色BUT處理的L02細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)1.0 mM的BUT即可引起線粒體損傷，且線粒體損傷程度與BUT濃度成正比。隨著濃度的增加代表線粒體膜電位下降的綠色熒光逐漸增加，直至4.0 mM時線粒體膜電位較高時的紅色熒光幾近消失。

3.5 BUT誘導(dǎo)L02細(xì)胞中ROS升高

為了進(jìn)一步研究BUT處理引起L02細(xì)胞損傷，使用熒光酶標(biāo)儀測量了細(xì)胞中活性氧的水平。實(shí)驗(yàn)表明，直接暴露于BUT 12 h后，與未處理的細(xì)胞相比，細(xì)胞中ROS的含量隨著BUT的濃度增加呈劑量依賴性升高（圖5）。

3.6 L02細(xì)胞中Caspase-3活性與表達(dá)量升高

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，Caspase-3可被激活，因此對BUT處理的L02細(xì)胞的Caspase-3的活性進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組 Caspase-3比較，低濃度的BUT對細(xì)胞Caspase-3活性沒有明顯影響，當(dāng)濃度達(dá)到2.0 mM，Caspase-3的活性顯著升高，（P <0.01），4.0 mM BUT組的Caspase-3活性極顯著性地升高，（P <0.01）。（圖6a））。RT-qPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BUT濃度達(dá)到1.0 mM時，Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平也均顯著性升高（圖6b）和6c））。

3.7 BUT濃度增加凋亡相關(guān)蛋白的變化

NF-κB信號通路廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，參與多種基因的調(diào)控，對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)起著重要作用，因此我們通過RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測BUT處理的L02細(xì)胞中NF-κB是否活化。如圖7所示，BUT可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平活化NF-κB p65。這些結(jié)果表明，BUT可能是通過激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)L02細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

肝臟作為常見的毒性靶器官，它能夠代謝血液循環(huán)中的異物，以幫助清除體內(nèi)潛在毒素的影響。作為FDA批準(zhǔn)的常見食品添加劑，BUT被廣泛用于牛奶味食品中[24-25]。值得注意的是，食品成分安全是FDA的首要任務(wù)。但近年來，據(jù)報(bào)道BUT可能對人肺造成諸如支氣管炎的毒性作用。鑒于肝臟是代謝血液循環(huán)中的異物以幫助清除體內(nèi)潛在毒素的內(nèi)在作用的主要器官之一，因此有理由懷疑其是BUT的另一個潛在毒性靶器官。但是，關(guān)于由BUT引起的肝臟損害的報(bào)道很少。因此，本文的研究發(fā)現(xiàn)了BUT可以一定程度的引起肝損傷，為修訂BUT在食品中應(yīng)用的有限標(biāo)準(zhǔn)提供一些參考。

線粒體在細(xì)胞存活和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定維持中起著重要作用。線粒體的變化被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要形態(tài)學(xué)變化，并且被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的早期細(xì)胞標(biāo)志物[26]。在本研究中，研究了線粒體的2個參數(shù)：線粒體膜電位（MMP）和活性氧（ROS）濃度。這2個指標(biāo)從不同的肝毒性角度反映了細(xì)胞凋亡的基本機(jī)制。ROS在肝毒性機(jī)制中起作用，由于ROS水平升高會損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或DNA，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和線粒體功能障礙[27]。MMP主要檢測線粒體內(nèi)膜和外膜之間的電位差，這是早期評估潛在肝毒性藥物的常用指標(biāo)[28]。線粒體在細(xì)胞存活和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定維持中起著重要作用[29]。在目前的研究中，BUT暴露后，活細(xì)胞數(shù)量減少，線粒體膜電位降低，ROS濃度增加，Caspase-3的活力及蛋白表達(dá)量升高，表明BUT誘導(dǎo)的肝毒性可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

生物體內(nèi)最重要的信號傳導(dǎo)途徑之一是NF-κB通路，據(jù)報(bào)道，它可以激活與炎癥[30]，增殖，凋亡，轉(zhuǎn)移和侵襲[31]有關(guān)的基因，因此在細(xì)胞凋亡發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活通過NF-κB復(fù)合物的NF-κB p65成分的核易位而發(fā)生[32]。BUT已顯示在0.5～4.0 mM濃度下可促進(jìn)人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞的NF-κB活性。因此，BUT引起的L02細(xì)胞凋亡可能是通過激活NF-κB活信號通路來實(shí)現(xiàn)的。

總而言之，BUT雖是FDA批準(zhǔn)的常見食品添加劑，但在一定濃度下，應(yīng)考慮其對肝臟的毒性。

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