李剛，高天生，黎騁，李冬梅，梁偉，黃卓

(梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院，1.腫瘤科，2.病理科，3.院感科，廣西 梧州 543002)

鼻咽癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，好發(fā)于鼻咽黏膜處?，F(xiàn)階段治療手段較之前已取得較大的進(jìn)步，然而仍有部分患者治療后存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后并不理想[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因的檢測(cè)及靶向診治已成為現(xiàn)代學(xué)者研究的焦點(diǎn)[2-3]。伴侶蛋白攜帶t復(fù)合多肽1(chaperones carry T complex polypeptide 1，CCT)作為分子伴侶素，在哺乳動(dòng)物中由7～9種不同的亞基組成，且每個(gè)亞基的病理生理作用存在一定差異[4]。有研究[5]報(bào)道，CCT亞基γ與惡性腫瘤患者腫瘤細(xì)胞分化程度相關(guān)。但目前國內(nèi)外尚未見有CCT亞基γ和人鼻咽癌關(guān)系的研究報(bào)道。本研究首次通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)、免疫組化及免疫印跡法檢測(cè)人鼻咽癌組織及鼻咽粘膜慢性炎組織中CCT亞基γ表達(dá)情況，初步探討CCT亞基γ與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象 選擇2012年5月至2017年6月梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院隨訪資料完整的的活檢術(shù)標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)過病理試驗(yàn)證實(shí)，包括100例鼻咽癌患者的癌組織(鼻咽癌組)和60例鼻咽黏膜慢性炎患者的炎癥組織(鼻咽黏膜慢性炎組)。鼻咽癌組中，男性72例，女性28例；年齡19～76歲，平均(45.10±9.12)歲。鼻咽黏膜慢性炎組中，男性46例，女性14例；年齡17～78歲，平均(45.52±8.06)歲。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均已簽署知情同意書。鼻咽癌納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有鼻咽癌患者均經(jīng)過病理活檢診斷證實(shí)，并符合鼻咽癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)均為初發(fā)鼻咽癌患者；(3)在本次確診前未接受過放化療等抗腫瘤手段。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料不齊全；(2)精神異?；蛘J(rèn)知功能障礙者；(3)患其他惡性腫瘤者；(4)患有嚴(yán)重感染性及內(nèi)科疾(心肝腎肺腦等)病者。

1.1.2 主要儀器與試劑 PrimeScript RT(貨號(hào)：RR037A)和SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒(貨號(hào)：RR820A)均購自寶生物工程(大連)有限公司；CCT亞基γ(貨號(hào)：7203)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(貨號(hào)：113444562)引物交由上海生工生物工程有限公司，使用primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)；蛋白提取試劑盒(貨號(hào)：R0050)及紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：UV-1500)均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人CCT亞基γ抗體(貨號(hào)：10571-1-AP)和兔抗人GAPDH抗體(貨號(hào)：10494-1-AP)購自Proteintech公司，山羊抗兔二抗(貨號(hào)： A21020)購自艾美捷科技有限公司；BCA試劑盒(貨號(hào)：23227)購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè) 通過TRlzol法提取各組織標(biāo)本中總RNA，具體操作如下：取咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎組織50～100 mg，加入1 mL的TRlzol，對(duì)組織剪碎及勻漿，再加入氯仿，高速離心分離后，將上層(含有RNA的無色水樣層)移至新的EP管中，經(jīng)0.5 mL異丙醇處理，高速離心分離，棄上清，加入75%乙醇1 mL處理，高速離心分離，棄上清，室溫晾干，再加入20 μLDEPC水溶解，促溶后-80℃保存待用。利用Nanodrop法對(duì)RNA濃度、純度進(jìn)行定量，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：逆轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，反應(yīng)條件設(shè)置為：37 ℃，15 min×3次，85 ℃ 條件下5 s。CCT亞基γ(擴(kuò)增片段大小117 bp)上游引物序列：5’-GCAAGTGTGCCGCAATGTTCTACT-3’；下游引物序列：5’-TGTTCCACACCAGTCATGGCCTTA-3’。GAPDH(擴(kuò)增片段大小115 bp)上游引物序列：5’-TCAACAGCAACTCCCACTCTTCCA-3’；下游引物序列：5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3’。實(shí)施熒光定量PCR操作，總反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green Premix10 μL，上游和下游引物各1 μL，2 μL模板，6 μL去離子水。CCT亞基γ反應(yīng)條件設(shè)定為：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔCt法計(jì)算CCT亞基γ的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 免疫印跡檢測(cè) 將各組織標(biāo)本剪碎并在勻漿器中進(jìn)行勻漿，加入裂解液于勻漿中進(jìn)行勻漿，置于冰上，重復(fù)幾次后使組織盡量碾碎，裂解0.5 h后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心分離組織總蛋白。定量上清液蛋白，加上樣緩沖液，沸水浴10 min，予以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶密封2 h，添加CCT亞基γ一抗(稀釋1∶500)、GAPDH (稀釋1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，沖洗后，將相應(yīng)二抗(稀釋1∶5 000)與PVDF膜室溫下孵育1 h。ECL暗室曝光顯影，利用圖像掃描采集圖片數(shù)據(jù)(蛋白條帶灰度值)，蛋白相對(duì)表達(dá)量=灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.3 免疫組化檢測(cè) 將各組織標(biāo)本于10%的甲醛中固定，進(jìn)行切片脫蠟和復(fù)水，將切片放置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，沸水浴20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，將抗原修復(fù)的石蠟切片冷卻至室溫，通過雙蒸水浸泡10 min后，吸去切片表面雙蒸水，在10%山羊血清中室溫孵育30 min。吸去山羊血清，加CCT亞基γ一抗(稀釋1∶50)，4 ℃孵育過夜，吸去一抗，沖洗三遍。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(稀釋1∶200)，孵育1 h，沖洗3遍后，顯色封片。通過SDX-100倒置顯微鏡進(jìn)行攝片，免疫組化染色結(jié)果根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性率進(jìn)行判斷，其中染色強(qiáng)度為顏色從無色逐漸加深至棕褐色，表明染色度越明顯，CCT亞基γ陽性表達(dá)越明顯。CCT亞基γ陽性表達(dá)率=CCT亞基γ細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%/總細(xì)胞，其中0分為陰性；陽性率1%～25%為1分；陽性率26%～50%為2分；陽性率51%～75%為3分；陽性率在76%～100%為4分[7]。

1.2.4 臨床病理特征分析 整理全部鼻咽癌患者臨床資料，根據(jù)CCT亞基γ 蛋白相對(duì)表達(dá)中位值將鼻咽癌患者分為高低表達(dá)組，其中超過CCT亞基γ蛋白相對(duì)表達(dá)水平中位值的患者納入高表達(dá)組，低于CCT亞基γ蛋白相對(duì)表達(dá)水平中位值的患者納入低表達(dá)組[8]，并分析CCT亞基γ不同表達(dá)水平與鼻咽癌患者年齡、性別、吸煙史、原發(fā)腫瘤局部淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分期(distant lymph node metastases of the primary tumor，TNM分期)、復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及病理分型等臨床病理資料之間的關(guān)系。對(duì)2012年至2017年期在本院診治的鼻咽癌患者，以電話、門診檢查等方式進(jìn)行隨訪，每次隨訪做好記錄，以病理確診日作為觀察起點(diǎn)，隨防至2021年6月，分析CCT亞基γ不同表達(dá)水平對(duì)患者生存情況的影響，記錄患者的3年總生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCT亞基γ mRNA的表達(dá)水平

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻咽癌組CCT亞基γ mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于鼻咽黏膜慢性炎組(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組織標(biāo)本中CCT亞基γ蛋白表達(dá)情況

免疫組化及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻咽癌組CCT亞基陽性表達(dá)率評(píng)分及蛋白水平均高于鼻咽黏膜慢性炎組(P<0.05)，并根據(jù)CCT亞基γ蛋白相對(duì)表達(dá)中位值將鼻咽癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，每組各50例。見圖2。

2.3 CCT亞基γ表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理資料之間的關(guān)系

CCT亞基γ蛋白表達(dá)水平與鼻咽癌患者的TNM分期、復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、吸煙史、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及病理分型無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 CCT亞基γ蛋白表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理資料之間的關(guān)系[n(%)]

2.4 CCT亞基γ基因表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響

CCT亞基γ蛋白高表達(dá)水平患者3年總生存率為68.00%，低于CCT亞基γ低表達(dá)水平患者的92.00%(χ2=3.984，P=0.046)。見圖3。

3 討論

鼻咽癌是發(fā)病于鼻咽頂壁及咽隱窩的常見惡性腫瘤，全球發(fā)病率及死亡率較高，對(duì)放化療比較敏感，早期患者予以積極治療，生存預(yù)后尚可，而中晚期患者已出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，往往患者預(yù)后不佳。因此，有必要探究鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找有助于鼻咽癌診治及預(yù)后判斷的新型腫瘤標(biāo)志物。

分子伴侶素是一類能特異結(jié)合及釋放底物蛋白的蛋白分子，在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和古細(xì)菌中均有分布，主要以由8個(gè)不同的亞基排成的一個(gè)中空柱狀體CCT為代表?，F(xiàn)代研究多集中于CCT亞基α與腫瘤發(fā)展機(jī)制的報(bào)道[9-10]，而關(guān)于CCT亞基γ在鼻咽癌組織中表達(dá)及其與患者病理特征和預(yù)后關(guān)系尚未見報(bào)道。近些年來，譚曉虹等[5]研究發(fā)現(xiàn)，伴侶素CCT亞基γ在肝癌組織中呈異常高表達(dá)水平，且與肝癌患者腫瘤細(xì)胞的分化密切相關(guān)，表明CCT亞基γ可能參與腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌組CCT亞基γmRNA、陽性表達(dá)率評(píng)分及蛋白水平均高于鼻咽黏膜慢性炎組(P<0.05)，提示鼻咽癌組織中呈高表達(dá)水平，推測(cè)CCT亞基γ可能參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展；其原因可能是有關(guān)上游非編碼RNA的CCT亞基γ靶基因，在鼻咽癌組織中呈低表達(dá)水平，進(jìn)而靶向上調(diào)了鼻咽癌組織中CCT亞基γ表達(dá)。肖晶鑑[11]研究報(bào)道m(xù)ir-24在鼻咽癌細(xì)胞中呈低表達(dá)水平，且已有研究[12]證實(shí)，mir-24與CCT亞基γ之間呈靶向負(fù)調(diào)控關(guān)系，進(jìn)而mir-24低表達(dá)通過靶向上調(diào)CCT亞基γ水平起到參與癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。但具體分子生物學(xué)作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本研究臨床病理特征分析結(jié)果顯示，CCT亞基γ表達(dá)水平與鼻咽癌患者的TNM分期、復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、吸煙史、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及病理分型無關(guān)(P<0.05)。TNM分期是反應(yīng)鼻咽癌原發(fā)腫瘤侵犯程度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)，而TNM分期III～I(xiàn)V期鼻咽癌組織中CCT亞基γ高表達(dá)占比較多，說明CCT亞基γ的高表達(dá)參與了鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，促進(jìn)鼻咽癌患者病情的發(fā)生發(fā)展，并增加了患者治療后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。有研究[13-15]認(rèn)為，CCT亞基γ的高表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有絲分裂及增殖，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對(duì)鼻咽癌的發(fā)生進(jìn)展具有促進(jìn)意義；其次CCT3誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS和能量代謝中游離氨基酸的失衡來抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖分化，參與疾病的進(jìn)展[16]；另外，CCT3基因表達(dá)上調(diào)與絲裂原活化蛋白激酶激酶7、細(xì)胞分裂周期42、細(xì)胞周期蛋白D3上調(diào)、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2、6下調(diào)有關(guān)，進(jìn)而對(duì)CCT3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[17]。而譚曉虹等[5]研究則認(rèn)為，CCT亞基γ的高表達(dá)水平與腫瘤分化程度有關(guān)，與腫瘤臨床分期、年齡等無關(guān)，原因可能與本研究納入病例不夠豐富、疾病種類不同及對(duì)每一例患者進(jìn)行直接上門隨訪各種原因的限制等原因有關(guān)。后期研究值得進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以及完善隨訪效果，以進(jìn)一步明確CCT亞基γ與鼻咽癌病理發(fā)展的關(guān)系。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CCT亞基γ高表達(dá)水平患者的3年總生存率為68.00%，低于CCT亞基γ低表達(dá)水平患者92.00%(P<0.05)，提示CCT亞基γ高表達(dá)水平預(yù)示鼻咽癌患者預(yù)后不良，原因可能是CCT亞基γ高表達(dá)水平促進(jìn)鼻咽癌的疾病進(jìn)展，進(jìn)而縮短了患者的生存時(shí)間。同時(shí)臨床上通過檢測(cè)鼻咽癌組織中CCT亞基γ水平，有助于患者預(yù)后生存情況的評(píng)估。因此CCT亞基γ有望成為鼻咽癌臨床分期、復(fù)發(fā)及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)術(shù)前方案制定、術(shù)后輔助治療及預(yù)后評(píng)估具有一定的輔助指導(dǎo)價(jià)值。

綜上，CCT亞基γ在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)水平，與鼻咽癌患者臨床分期及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，CCT亞基γ水平的增高預(yù)示著患者預(yù)后不良。