劉 琪 陳曉佳 方炳雄 洪妙玲 莊蓓麗

廣東省普寧市人民醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心，廣東普寧 515300

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一種球形無(wú)包膜環(huán)狀雙鏈DNA病毒，主要通過性傳播感染人皮膚和黏膜上皮。宮頸癌是目前女性最常見的生殖道惡性腫瘤，極大地威脅著女性的生命和生殖健康，HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因[1]。當(dāng)前隨著磁珠法在病毒核酸檢測(cè)中的普及應(yīng)用，全自動(dòng)核酸提取儀利用磁珠法提取核酸，提高了核酸的提取效率，降低了人工操作誤差，實(shí)現(xiàn)了病毒核酸的高靈敏與高通量檢測(cè)[2-4]。但是在新試劑和新儀器應(yīng)用前，需進(jìn)行相關(guān)性能驗(yàn)證。D'Souza等[5]也指出前處理方法的不同也會(huì)影響HPV的分型結(jié)果。因此本研究通過比較磁珠法與傳統(tǒng)手工法（分離法）兩種提取核酸的方法在HPV分型結(jié)果的一致性，利用室間質(zhì)評(píng)來評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度，比較兩種提取方法的DNA濃度與A260/A280比值，從這三個(gè)方面來評(píng)價(jià)全自動(dòng)核酸提取儀在HPV分型檢測(cè)中的應(yīng)用，為實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)HPV全自動(dòng)核酸提取提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集普寧市人民醫(yī)院門診婦產(chǎn)科和性病科2020年12月至2021年1月114份女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本和21份男性下生殖道分泌物標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：適合用陰道張開器暴露宮頸取材，錯(cuò)開月經(jīng)期的成年女性；取材順利的成年男性；愿意參與本實(shí)驗(yàn)室研究，臨床資料完整的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重疾病；行宮頸切除術(shù)后的女性患者；不能完成本研究全過程的患者。

1.2 儀器與試劑

磁珠法的提取試劑、分離法的提取試劑、HPV核酸擴(kuò)增試劑、HPV雜交檢測(cè)試劑盒以及宮頸脫落細(xì)胞保存液均來自潮州凱普生物化學(xué)有限公司。儀器主要有全自動(dòng)核酸提取儀（潮州凱普生物化學(xué)有限公司HBNP-4801A）、超微量分光光度計(jì)（賽默飛NanoDrop2000）、PCR擴(kuò) 增 儀（東 勝ETC811）、AutoMax全自動(dòng)核酸分子雜交儀（潮州凱普生物化學(xué)有限公司HBHM-900A）、干式恒溫器（杭州奧盛儀器有限公司）等。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 樣本采集 所有標(biāo)本采集均經(jīng)過醫(yī)生征得患者知情同意。女性宮頸脫落細(xì)胞由醫(yī)生以陰道張開器暴露宮頸，在宮頸口輕輕搓動(dòng)，宮頸刷使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)幾周，確保取得足夠量的脫落細(xì)胞，取出宮頸刷，將其放入取樣管中。男性用細(xì)小棉拭子伸入尿道2～5 cm，捻動(dòng)拭子采集脫落細(xì)胞。2020年廣東省臨床檢驗(yàn)中心發(fā)放的10份室間質(zhì)評(píng)DNA標(biāo)本。

1.3.2 HPV DNA的提取 ①磁珠法：將標(biāo)本充分混勻，轉(zhuǎn)移300 μl標(biāo)本到96深孔板，按照試劑說明書加入相應(yīng)的試劑，置于全自動(dòng)核酸提取儀HBNP-4801A中。通過破裂細(xì)胞以釋放DNA，利用磁珠吸附原理，通過磁棒吸附、轉(zhuǎn)移和釋放磁珠，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)完成核酸的提取，60 μl TE溶液溶解DNA。②分離法：將標(biāo)本振蕩混勻，轉(zhuǎn)移800 μl到EP管中，10 000 g離心5 min，去上清。加入溶液Ⅰ400 μl充分振蕩混勻，在干式恒溫器上100℃加熱15 min。瞬時(shí)離心后，加入400 μl異丙醇，振蕩混勻后，室溫靜置2 min，10 000 g離心5 min，去盡上清液。室溫靜置10 min后，加入60 μl TE溶液溶解DNA，靜置10 min后，10 000g離心5 min，上清液即可用于PCR擴(kuò)增。③DNA濃度比較的時(shí)候，磁珠法提取DNA濃度值/3×8校正之后，再與分離法比較，使得兩種方法的初始標(biāo)本量一致。

1.3.3 HPV DNA擴(kuò)增 取1 μl的HPV DNA模板加入到擴(kuò)增試劑體系中，按下列PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行基因擴(kuò)增：20℃ 10 min；預(yù)變性95℃ 9 min；變性95℃ 20 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃ HOLD。

1.3.4 雜交 采用基因擴(kuò)增技術(shù)及導(dǎo)流雜交原理，雜交膜上包被有基因型別特異性探針與變性擴(kuò)增產(chǎn)物（單鏈DNA）進(jìn)行雜交，采用堿性磷酸酶系統(tǒng)定性檢測(cè)，從而對(duì)21種HPV基因亞型[高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68亞型；低危型：6、11、42、43、44和CP8304（81）亞型]進(jìn)行分型檢測(cè)。

1.3.5 準(zhǔn)確度 通過分析2020年廣東省臨床檢驗(yàn)中心室間的質(zhì)評(píng)結(jié)果，從室間質(zhì)評(píng)結(jié)果比對(duì)實(shí)驗(yàn)室定性檢測(cè)結(jié)果的一致性，從而評(píng)價(jià)和判斷利用兩種不同提取方法的DNA對(duì)實(shí)驗(yàn)室定性檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較DNA濃度，使用箱式圖繪制，進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)分析；比較A260/A280比值，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種核酸提取方法對(duì)114份女性宮頸脫落細(xì)胞樣本的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，當(dāng)kappa值≥0.75時(shí)，認(rèn)為一致性較好；0.4＜kappa值＜0.75時(shí)，認(rèn)為一致性一般；當(dāng)kappa值≤0.4時(shí)，認(rèn)為一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 兩種核酸提取方法的結(jié)果比較

2.1.1 女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果 將114份女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本充分混合后，利用磁珠法和分離法進(jìn)行核酸提取。對(duì)兩種核酸提取方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，kappa值為0.950，認(rèn)為磁珠法和分離法進(jìn)行核酸提取在HPV分析中的檢測(cè)結(jié)果一致性較好，見表1。

表1 女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 男性脫落細(xì)胞標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果 在21份男性脫落細(xì)胞標(biāo)本中加入1000 ml的生理鹽水，充分振蕩后，利用磁珠法和分離法進(jìn)行核酸提取。其中磁珠法的基因擴(kuò)增反應(yīng)質(zhì)量控制點(diǎn)（IC點(diǎn)）和雜交顯色質(zhì)量控制點(diǎn)均顯色，檢測(cè)成功率為100.00%（21/21）；分離法的21份標(biāo)本中有2份IC質(zhì)量控制點(diǎn)失控，檢測(cè)失敗，檢測(cè)成功率為90.47%（19/21），見表2。

表2 男性脫落細(xì)胞標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確度比較

10份室間質(zhì)評(píng)樣本分別利用磁珠法和分離法進(jìn)行DNA提取，兩種提取方法的HPV分型檢測(cè)結(jié)果與省室間質(zhì)控結(jié)果均一致，結(jié)果一致率為100.00%（10/10）。兩種提取方法的HPV分型結(jié)果準(zhǔn)確度符合要求，見表3。

表3 兩種核酸提取方法的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 DNA濃度與A260/A280比值比較

由于磁珠法和分離法提取時(shí)，加入的樣本量不一致，其中磁珠法是用300 μl樣本進(jìn)行提取，分離法是用800 μl樣本進(jìn)行提取。為了更好地比較兩種提取方法對(duì)DNA濃度的影響，本研究磁珠法提取DNA濃度值/3×8進(jìn)行校正后，再與分離法比較，使得兩種方法的初始標(biāo)本量一致。磁珠法提取的DNA濃度箱式圖顯示中位數(shù)為20.53 μg/ml，四分位數(shù)為（12.53，44.00）μg/ml；分離法提取的DNA濃度箱式圖顯示中位數(shù)為11.30 μg/ml，四分位數(shù)為（3.60，30.10）μg/ml，磁珠法提取DNA的濃度比分離法高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.600，P=0.001），見圖1。

圖1 兩組提取方法的DNA濃度的比對(duì)

磁珠法提取的DNA A260/A280比值為（1.60±0.06），分離法為（1.27±0.12），磁珠法提取DNA的純度比分離法高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.972，P=0.001），見圖2。

圖2 兩種提取方法的DNA A260/A280比值的比對(duì)

3 討論

隨著HPV疫苗的推廣以及宮頸癌防治知識(shí)的不斷普及，廣大女性對(duì)宮頸癌認(rèn)知程度逐漸提高。但是調(diào)查表明，中國(guó)大學(xué)女性HPV疫苗知曉率和接種率普遍較低，需要加強(qiáng)相關(guān)宣傳和疫苗接種工作[6]。HPV感染率在普遍人群中并不低，方炳雄等[7]前期研究結(jié)果顯示，本地區(qū)19 178例女性樣本HPV感染率為16.94%，并且以高危型HPV感染為主（81.55%）。深圳市羅湖區(qū)HPV女性感染率為19.77%[8]。高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染，可引起陰道微生態(tài)異常，導(dǎo)致宮頸病變[9]。宮頸癌的發(fā)生，主要由高危型HPV持續(xù)感染導(dǎo)致，對(duì)HR-HPV進(jìn)行分型檢測(cè)，實(shí)施高危人群的分層管理對(duì)降低宮頸癌和癌前病變發(fā)生具有重要意義[10]。在日常工作中發(fā)現(xiàn)，女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本中血性標(biāo)本和多黏液樣本還是占有一定比例的，血性樣本可能與采樣時(shí)間或者采樣部位有病變有關(guān)系。許瓊等[11]指出血性樣本在高血紅蛋白的情況下，會(huì)抑制PCR反應(yīng)，干擾HPV分型檢測(cè)的結(jié)果。而多黏液樣本中存在大量的黏液蛋白，影響DNA的提取質(zhì)量。在分離法試劑說明書中提及針對(duì)多血液樣本和多黏液樣本的前處理，針對(duì)多血液樣本要先利用已滅菌的純化水進(jìn)行一次或多次漂洗；針對(duì)多黏液樣本需要充分振蕩混勻，必要時(shí)需取出取樣刷來吸取底部樣本，增加了工作步驟而且也增加交叉污染的可能性。因此，尋求一種高效率、高質(zhì)量的HPV核酸提取方法能更好地服務(wù)臨床。

本研究共收集114份女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本、21份男性脫落細(xì)胞標(biāo)本以及10份室間質(zhì)控品來評(píng)價(jià)磁珠法與分離法在HPV分型檢測(cè)中的應(yīng)用，結(jié)果顯示，磁珠法與分離法在HPV分型檢測(cè)中結(jié)果一致性較好（kappa值為0.950），室間質(zhì)評(píng)檢測(cè)結(jié)果的一致率為100.00%。提示兩種核酸提取方法的檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

影響DNA濃度的因素很多，除了初始樣本量、提取方法外，還受提取后加入的溶解DNA溶液量的影響。磁珠法按試劑說明書中加入300 μl的振蕩混合后的樣本進(jìn)行提取的，而分離法則是加入800 μl的振蕩混合后的樣本進(jìn)行提取的；兩種方法都是使用60 μl TE溶液溶解DNA；本研究在DNA濃度比較的時(shí)候，磁珠法提取DNA濃度值校正之后，再與分離法比較，使得兩種方法的初始標(biāo)本量一致。比較兩種提取方法，磁珠法提取DNA的濃度比分離法高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

女性宮頸脫落細(xì)胞樣本中存在部分血性樣本和多黏液樣本。血性樣本中含有血紅蛋白，多黏液樣本中含有大量的蛋白質(zhì)，分離法無(wú)法完全去除，使得分離法提取的DNA中殘存有蛋白質(zhì)，A260/A280的比值偏低。A260/A280的比值是核酸純度的指標(biāo)，判定有無(wú)蛋白質(zhì)污染。而磁珠法是將游離的核酸分子特異地吸附到磁性顆粒表面，經(jīng)過兩次洗滌，能較好地將樣本中的黏液蛋白等雜質(zhì)有效去除，從而保證提取核酸溶液的高純度。

男性HPV陽(yáng)性感染率不低，多重感染患者中，以高低危亞型混合感染為主[12]。男性HPV混合亞型的增加，尤其是高危HPV感染的增加，由于男性高危HPV感染者可以通過性傳播感染女性，因此對(duì)男性HPV感染者基因型檢測(cè)并進(jìn)行積極治療，對(duì)預(yù)防和減少女性HPV高危感染以及預(yù)防宮頸癌的發(fā)生具有重要意義[13-14]。但是由于男性脫落細(xì)胞樣本因?yàn)槿恿啃?，在臨床工作中提取失敗的可能性較大。在本研究中，同時(shí)利用磁珠法與分離法對(duì)同一男性脫落細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，結(jié)果顯示分離法在21份樣本中有2份檢測(cè)失敗，分析原因發(fā)現(xiàn)這2份樣本的DNA濃度兩種核酸提取方法均小于5 μg/ml，利用磁珠法提取的DNA純度在1.5左右，而分離法在0.5左右。表明磁珠法在樣本量較少的情況下，仍能保持較高的DNA純度，提高檢測(cè)的靈敏度。

有學(xué)者對(duì)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)18種HR-HPV進(jìn)行性能驗(yàn)證，性能良好，能達(dá)到科研和臨床的要求[15]。基于二代測(cè)序的宏基因組高通量測(cè)序平臺(tái)也為HPV分型檢測(cè)提供新的思路。但因質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)、高通量測(cè)序平臺(tái)價(jià)格昂貴、技術(shù)操作難度較高，尚未能在臨床上廣泛應(yīng)用[16]。

綜上所述，磁珠法提取的HPV-DNA濃度和純度更高，能達(dá)到下游檢測(cè)的檢測(cè)限，在取樣量較少的男性脫落細(xì)胞中有明顯優(yōu)勢(shì)。而且全自動(dòng)核酸提取儀具有操作簡(jiǎn)便、減少人工失誤、能實(shí)現(xiàn)大通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，更適合臨床應(yīng)用。