王 瑩，高 麗，金紅宇，馬雙成 綜述，昝 珂△，倪 健 審校

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 102629；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029)

枸杞子作為我國傳統(tǒng)的中藥材和重要經(jīng)濟作物，同時作為藥食同源產(chǎn)品，日常應(yīng)用極為廣泛。枸杞廣泛分布于我國的寧夏、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古、河北等地，其中寧夏被認為是枸杞的主要道地藥材產(chǎn)區(qū)。2015年版《中華人民共和國藥典》收載的枸杞品種為寧夏枸杞，這也是目前市場上的主流產(chǎn)品。枸杞中的化學(xué)成分較為復(fù)雜，包括多糖類、生物堿、類胡蘿素、黃酮類、微量元素、氨基酸、維生素[1]等。其中枸杞多糖(LBP)作為枸杞中的主要成分，其藥理活性研究已成為學(xué)者們關(guān)注的熱點問題。已有研究表明，LBP具有多種生物活性，包括抗腫瘤[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、降血脂[4]、降血糖[5]、視網(wǎng)膜保護[6]和保肝[7]等功能。其中關(guān)于免疫調(diào)節(jié)作用研究更是熱點問題，已有報道將LBP作為新型疫苗的免疫佐劑使用，被證明具有較好的功效[8]。多糖作為一種天然大分子化合物，其免疫調(diào)節(jié)作用研究一直是熱點問題。尤其從20世紀90年代起，陸續(xù)開發(fā)了注射用香菇多糖、注射用黃芪多糖等產(chǎn)品，這些產(chǎn)品在臨床上可用作腫瘤治療輔助用藥，調(diào)節(jié)機體免疫功能，有著高療效、低毒性等特性。

機體一般通過免疫器官、免疫細胞及免疫活性物質(zhì)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。除了經(jīng)典的免疫調(diào)節(jié)途徑外，隨著腸道菌群研究的不斷深入，認為低生物利用度的藥品可通過滯留腸道而發(fā)揮腸菌群調(diào)節(jié)作用，進而影響免疫功能[9]，這也為多糖免疫調(diào)節(jié)作用及機制研究提供了新的思路。本文對近年來有關(guān)LBP免疫調(diào)節(jié)功能及作用機制的報道進行梳理和總結(jié)，以期為LBP免疫調(diào)節(jié)機制的進一步研究和探索提供參考和思路。

1 對免疫器官的作用

機體免疫器官包括中樞免疫器官(胸腺、骨髓)和外周免疫器官(脾臟、淋巴結(jié)、咽扁桃體和腸集合淋巴結(jié))，是免疫細胞定居及免疫應(yīng)答發(fā)生的部位，研究表明LBP對于中樞和外周免疫器官均具有一定的調(diào)節(jié)作用。蔣艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)，LBP可抑制肝癌Hca-F荷瘤小鼠體內(nèi)實體瘤的生長，還可顯著提高小鼠脾臟和胸腺指數(shù)。羅瓊等[11]對枸杞粗多糖和高純度LBP的免疫調(diào)節(jié)作用進行對比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高純度LBP能顯著增加小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，顯示出更強的免疫調(diào)節(jié)功能。

李相玲[12]在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型實驗中發(fā)現(xiàn)，高劑量LBP可增加派氏結(jié)數(shù)目，且可提高腸道淋巴細胞比例，使其恢復(fù)到正常小鼠水平。派氏結(jié)是刺激分泌性免疫球蛋白A(sIgA)分泌的主要部位，可誘導(dǎo)細胞增殖分化以抵御腸道內(nèi)有害物質(zhì)侵襲，派氏結(jié)的大小、數(shù)量及淋巴細胞數(shù)量等均可作為反映腸道免疫的指標。

2 對免疫細胞的作用

免疫細胞是機體參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細胞及其前體，在特異性免疫及非特異性免疫中有重要作用。免疫細胞主要包括巨噬細胞、樹突細胞(DC)、自然殺傷細胞(NK)細胞及T、B淋巴細胞等。LBP能調(diào)節(jié)多種免疫細胞，且通過調(diào)節(jié)其生長和分化而產(chǎn)生機體免疫力增強效果。

2.1對巨噬細胞的影響 巨噬細胞是最早對病原微生物入侵進行應(yīng)答的免疫細胞，是天然免疫應(yīng)答的主要參與者，在免疫系統(tǒng)占據(jù)重要地位。被激活的巨噬細胞可釋放多種細胞因子，如白細胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等，這些細胞因子是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能的重要途徑。

2.1.1對巨噬細胞增殖的影響 LBP可分別通過調(diào)節(jié)其存活率、吞噬活性及細胞因子釋放等影響機體免疫力。楊青[13]在LBP對RAW264.7巨噬細胞調(diào)節(jié)作用的研究中發(fā)現(xiàn)，LBP能顯著提高巨噬細胞的數(shù)量，重新調(diào)定極化狀態(tài)，促進其向M1的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。ZHANG等[3]從枸杞中分離得到高純度多糖LBPF4-OL進行研究，發(fā)現(xiàn)其能明顯刺激小鼠巨噬細胞增殖，進而提高機體免疫功能。

2.1.2對巨噬細胞吞噬活性的影響 巨噬細胞的吞噬活性反映了吞噬病原體的能力，是巨噬細胞活性的重要指標之一。黎雪如等[14]研究指出，LBP通過增加巨噬細胞表面C3b和Fc受體的數(shù)量和活力提高巨噬細胞的吞噬能力，其中C3b和Fc作為巨噬細胞表面受體，其數(shù)量和活性與巨噬細胞吞噬能力密切相關(guān)。

2.1.3對巨噬細胞細胞因子釋放的影響 有研究指出，LBP可通過刺激巨噬細胞釋放細胞因子，從而發(fā)揮其免疫作用[13]。許忠新等[15]采用MTT法檢測巨噬細胞對肝癌細胞株Bel-7402生長的抑制作用，以評價LBP對健康人外周血中巨噬細胞功能的影響。該研究結(jié)果表明，LBP在50～100 μg/mL濃度下可顯著提高巨噬細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，同時刺激巨噬細胞分泌TNF-α等炎性細胞因子；張小銳[16]考察了從枸杞中分離所得的多糖LBPF4-OL對小鼠巨噬細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBPF4-OL對巨噬細胞中TNF-α 、IL-1β、干擾素(IFN)-α和IFN-β mRNA的表達量有明顯調(diào)節(jié)作用，并且進一步探索發(fā)現(xiàn)LBPF4-OL在巨噬細胞上的作用位點可能是Toll樣受體 (TLR)4和TLR2。

此外，巨噬細胞可分泌一氧化氮(NO)，其作為具有生物活性的細胞信使因子在殺滅病原微生物等方面發(fā)揮作用。許金霞[17]研究發(fā)現(xiàn)，LBP可刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表達，iNOS作為關(guān)鍵酶水平的其表達，增加可促進NO的生成，從而發(fā)揮免疫功能；同時該研究發(fā)現(xiàn)LBP對巨噬細胞的活化作用與激活TLR4受體有關(guān)。

2.2對淋巴細胞的影響 淋巴細胞根據(jù)其表型和功能可分為T淋巴細胞、B淋巴細胞，主要分布于外周免疫器官及血液中。LBP可通過影響淋巴細胞增殖能力、亞群數(shù)量和結(jié)構(gòu)及抗體分泌等對機體免疫功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)。

2.2.1對淋巴細胞增殖的影響 胡國俊等[18]研究表明，LBP對未經(jīng)活化的淋巴細胞沒有誘導(dǎo)增殖作用，然而對于分別經(jīng)植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)活化的T、B淋巴細胞增殖有顯著的促進作用(P<0.05)。張小銳[16]在對LBP和LBP蛋白復(fù)合物免疫活性比較中發(fā)現(xiàn)，LBP和LBP蛋白復(fù)合物均對B淋巴細胞有明顯促進增殖效果，且其在B淋巴細胞上的作用位點可能是CD19和TLR4受體。

2.2.2對T淋巴細胞亞群的影響 一般研究認為，成熟T細胞主要分為CD4+、CD8+細胞。細胞CD4+可分為Th1、Th2細胞,調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)，Th17細胞和Tfh細胞，這些細胞可分泌細胞因子，從而達到調(diào)節(jié)細胞和體液免疫應(yīng)答的效果；CD8+細胞具有免疫抑制和細胞毒性作用。這2種細胞的數(shù)量和比值常用來作為評價免疫功能的重要指標[19]。胡國俊等[18]考察了LBP對T淋巴細胞亞群的影響，結(jié)果表明LBP可提高脾臟中CD4+/CD8+比例，同時增加CD4+T細胞數(shù)量，表現(xiàn)為免疫正向調(diào)節(jié)功能。BO等[8]制備了LBP的脂質(zhì)體，并考察了經(jīng)其干預(yù)后正常小鼠體內(nèi)T淋巴細胞亞群及細胞因子的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LBP脂質(zhì)體可有效地刺激體內(nèi)CD4+、CD8+T細胞的增殖，并提高CD4+T細胞與CD8+T細胞比例。

2.2.3對淋巴細胞分泌抗體的影響 抗體主要存在于血清等體液中，是B淋巴細胞受到抗原刺激后增殖分化為漿細胞后所產(chǎn)生的免疫球蛋白(Ig)，是介導(dǎo)機體免疫反應(yīng)的重要分子。符古雅等[20]以接觸氟化鈉(NaF)的28名工人作為觀察對象，考察LBP對機體免疫功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)受試者在服用LBP后，血漿中IgG、IgA、IgM水平均明顯提高，認為LBP可通過提高機體血清中的抗體水平，從而發(fā)揮機體免疫調(diào)節(jié)功能。BO等[8]在考察LBP脂質(zhì)體對正常小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能時也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LBP作用后小鼠體內(nèi)Ig水平明顯提高。

2.3對其他免疫細胞的影響 DC是啟動并調(diào)控細胞免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，是最強的抗原遞呈細胞。研究發(fā)現(xiàn)，多糖可通過誘導(dǎo)DC的分化、增殖及成熟，從而加強DC的抗原呈遞功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。郝習(xí)等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LBP不僅能增加DC的數(shù)量，還可促進小鼠DC的分化、成熟，提高DC細胞表面CD86和CD11a的表達，促進IL-12 的分泌，IL-12作為一種具有多種生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)因子，在刺激淋巴細胞增殖方面有重要作用。ZHU等[22]考察了LBP對DC的調(diào)節(jié)作用及作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBP可與DC表面TLR2和(或)TLR4受體結(jié)合，進一步激活胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號途徑，從而誘導(dǎo)DC表型和功能成熟。此外，劉彥平等[23]采用環(huán)磷酰胺小鼠抑制模型考察了LBP的免疫調(diào)節(jié)功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBP作用后小鼠體內(nèi)白細胞數(shù)量顯著增加，同時可改善環(huán)磷酰胺誘發(fā)的自然殺傷(NK)細胞活性降低狀態(tài)。

2.4枸杞多糖對細胞受體及信號通路的影響 已有研究報道指出，植物多糖可通過特異性的結(jié)合細胞表面受體，激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NF-κB等下游信號通路，從而促進TNF-α、NO、IL-6及IFN-γ等細胞因子的釋放，最終達到免疫調(diào)控的目的。已被證實的植物多糖受體包括TLR-4、清道夫受體(SR)、甘露糖受體(MR)及補體受體3(CR3)[24]。

近年來，研究學(xué)者逐漸開展了LBP免疫調(diào)節(jié)信號通路的研究。CHEN等[25]在考察LBP蛋白復(fù)合物對T細胞調(diào)節(jié)作用的報道中發(fā)現(xiàn)，LBP可激活T細胞核因子(NFAT)，促進CD25的表達，同時誘導(dǎo)IFN-γ和IL-2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達；XIAO等[26]考察了LBP對肝損傷模型的免疫調(diào)節(jié)功能，結(jié)果表明LBP免疫調(diào)節(jié)作用與TLR4/2受體相關(guān)，認為LBP與受體結(jié)合后可影響細胞內(nèi)信號調(diào)控的蛋白激酶/細胞外信號調(diào)控的蛋白激酶(MEK/ERK)、核因子-κB(NF-κB)及c-Jun氨基末端激酶(JNK)/c-Jun等通路，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；ZHANG等[2]考察了LBP對小鼠腹腔巨噬細胞的作用機制，該研究結(jié)果表明，LBP可顯著上調(diào)巨噬細胞上TLR4/MD2的表達，增加p38 MAPKs的磷酸化，表明LBP是一種新的TLR，同時是MAPKs信號通路激活劑和誘導(dǎo)劑。

3 LBP基于對腸道菌群調(diào)節(jié)的免疫活性研究

人體腸道共居住著約3 500種微生物，其中有1 000余種細菌，包括需氧菌和厭氧菌(占總數(shù)的90%以上)。腸道菌群不僅參與人體的吸收代謝，還與結(jié)腸癌等腸道疾病、肥胖、2型糖尿病、自身免疫性疾病等緊密相關(guān)，故近年來腸道菌群的研究備受各國學(xué)者關(guān)注，已有研究指出腸道菌群對于機體免疫能力有重要的影響[27]。

近年來，研究人員逐步開展了有關(guān)植物多糖基于腸道菌群調(diào)節(jié)的免疫活性研究，并初步認為多糖免疫功能的發(fā)揮與其對腸道菌群的調(diào)節(jié)之間有密切關(guān)系，認為主要通過以下幾方面發(fā)揮作用：(1)可保障腸道黏液層完整，發(fā)揮黏膜屏障作用。通常認為黏液層的存在及保證黏液層結(jié)構(gòu)的完整可有效防止細菌移位，對發(fā)揮腸道免疫功能有重要作用。SUN等[28]研究發(fā)酵與未發(fā)酵的玉屏風(fēng)多糖對斷奶獺兔腸屏障的影響時發(fā)現(xiàn)，2種玉屏風(fēng)多糖均能改善腸道菌群平衡，激發(fā)杯狀細胞分泌黏蛋白，從而維持腸屏障完整性及維護腸道黏膜的功能。(2)可誘導(dǎo)產(chǎn)生sIgA。sIgA可與腸道內(nèi)抗原及微生物結(jié)合，刺激機體產(chǎn)生體液免疫，是腸黏膜表面最重要的Ig[29]。有報道指出，無菌小鼠體內(nèi)腸黏膜免疫力不足，腸系膜淋巴結(jié)也發(fā)育不良，且可分泌IgA的漿細胞數(shù)量也較少，但當無菌小鼠體內(nèi)移植入普通小鼠的腸道菌群后，此種狀態(tài)即發(fā)生逆轉(zhuǎn)[30]。故認為腸道微生物可誘導(dǎo)IgA的產(chǎn)生，從而提高腸道免疫調(diào)節(jié)作用。(3)誘導(dǎo)T淋巴細胞的產(chǎn)生和分化：T細胞通過Th及Treg等細胞完成腸黏膜免疫屏障作用，是維持腸道免疫重要的免疫細胞。其中Th17可分泌多種細胞因子，如IL-17A、IL-17F和IL-22等，是腸道先天性免疫屏障的重要組成部分。而某些特殊菌群可刺激T細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。已有研究證實，分節(jié)絲狀菌可誘導(dǎo)腸道產(chǎn)生Th17細胞，從而促進機體的免疫反應(yīng)[31]。脆弱型擬桿菌產(chǎn)生的多糖A 能誘導(dǎo)Treg細胞的分化，進而促進分泌IL-10，發(fā)揮抗炎癥的作用[32]。此外，梭狀芽孢桿菌Ⅳ簇和ⅪⅤa簇可誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的產(chǎn)生，同時刺激T細胞分化為Treg細胞[33]，與脆弱型擬桿菌具有相似的調(diào)控作用。

綜上所述，腸道菌群可對機體腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育、淋巴細胞反應(yīng)等產(chǎn)生影響，而植物多糖通過調(diào)節(jié)腸道菌群的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)發(fā)揮對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。目前，已有少量研究人員初步考察了LBP對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，ZHU等[34]考察了LBP對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，LBP可提高一些潛在的益生菌屬的相對豐度，如阿克曼氏屬、普雷沃菌和乳桿菌等；而在門水平上，LBP明顯降低了擬桿菌門的相對豐度，提高厚壁菌的相對數(shù)量。DING等[35]以免疫抑制小鼠模型作為研究對象，考察了LBP對腸道微生物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LBP可顯著增加類桿菌科和乳桿菌科的相對豐度，促進短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，并初步探討了LBP對腸道菌群調(diào)節(jié)與對機體免疫功能影響之間的相關(guān)性。程翔馴[36]以鹽酸林可霉素灌胃獲得腸道菌群失調(diào)的小鼠模型，并注射LBP以考察其效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，LBP干預(yù)后小鼠腸道中雙歧桿菌、乳桿菌和腸桿菌的相對豐度顯著提高；且同時發(fā)現(xiàn)LBP作用后小鼠腸道菌群的多樣性明顯優(yōu)于模型組，認為LBP是理想的腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑。

4 結(jié)語與展望

LBP是通過多個途徑、多個層面、多個靶點對免疫系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)劑作用的，可以改善免疫器官損傷，同時對T細胞、B細胞及巨噬細胞等主要免疫細胞產(chǎn)生影響，從而達到對機體免疫功能調(diào)節(jié)的目的。迄今為止，有研究初步闡述了LBP免疫活性及其作用途徑，但仍有一些問題尚待解決。(1)LBP作為一種水溶性大分子，其胃腸吸收情況及LBP的生物利用度對闡述LBP免疫調(diào)節(jié)功能作用途徑有重要意義。但目前關(guān)于LBP免疫活性的研究主要側(cè)重于通過免疫器官或者外周血指標檢測來反映其免疫調(diào)節(jié)功能，未結(jié)合LBP機體實際吸收利用情況，這既不利于整體闡述LBP的免疫作用途徑，又很難通過此類研究給出一個合理的推薦使用劑量。(2)隨著近年來腸道菌群研究的興起，對于植物多糖免疫作用機制研究無疑是開辟了新思路。然而迄今為止，關(guān)于LBP腸道菌群的研究有限，且報道多限于單純測定菌群結(jié)構(gòu)或比例，而缺乏整體作用途徑及相關(guān)通路的研究。(3)由于各實驗室提取分離多糖的工藝步驟不同，導(dǎo)致得到LBP產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、純度均有很大差異，這種差異極可能導(dǎo)致免疫活性強弱及作用機制有所不同。同時由于缺乏多糖質(zhì)量控制標準，導(dǎo)致實驗的重復(fù)性無法考察，給后續(xù)相關(guān)藥物開發(fā)帶來困難[37]。故對LBP初級結(jié)構(gòu)進行解析，針對工藝形成相對的質(zhì)控方法，對于LBP免疫調(diào)節(jié)機制及構(gòu)效關(guān)系研究都具有重要意義，且可以為LBP產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

LBP作為一種有潛力的免疫調(diào)節(jié)劑，應(yīng)進一步多角度、全方位地對其免疫調(diào)節(jié)作用進行探索，以期為LBP免疫機制的闡述、產(chǎn)品的開發(fā)及臨床化提供理論參考。