楊越，陶瑞旸，李敏，3，于歡，4，陳麗琴，王亞麗，李成濤

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010030；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海200063；3.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都610041；4.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)系，江蘇 蘇州215000

Y 染色體遺傳標(biāo)記由于父系遺傳的特點(diǎn)，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。目前，法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要采用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)Y 染色體上短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，用于家系檢索或親緣關(guān)系鑒定。近年來(lái)，二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)發(fā)展迅速，可以完成多類遺傳標(biāo)記的檢測(cè)，且測(cè)序成本也有較大的下降。學(xué)者們開(kāi)始嘗試應(yīng)用這一技術(shù)對(duì)Y染色體上STR與單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）遺傳標(biāo)記聯(lián)合檢測(cè)進(jìn)行更為精準(zhǔn)的Y 染色體信息溯源。本文擬闡述Y 染色體遺傳標(biāo)記的主要類型及其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用現(xiàn)況，介紹NGS 技術(shù)用于法醫(yī)遺傳學(xué)分子標(biāo)記檢測(cè)的主流平臺(tái)、原理以及應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，總結(jié)國(guó)內(nèi)外可用于檢測(cè)Y 染色體遺傳標(biāo)記的商品化NGS 試劑盒及自主構(gòu)建的NGS 檢測(cè)體系的性能，討論目前在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用NGS 技術(shù)仍待解決的問(wèn)題，并對(duì)NGS 技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 概 述

1.1 Y染色體遺傳標(biāo)記

Y 染色體獨(dú)屬于男性個(gè)體，在男性性狀發(fā)育中意義重大。其長(zhǎng)度約為60 Mb，占人類基因組總量的2%左右[1]。Y 染色體上不與X 染色體發(fā)生重組的區(qū)域稱為非重組區(qū)（non-recombining Y，NRY），約占整個(gè)染色體的95%。非重組區(qū)在同一家系的男性中世代穩(wěn)定遺傳（不考慮突變），呈現(xiàn)高度特異性和保守性。Y染色體上有STR 和SNP 兩類多態(tài)性遺傳標(biāo)記，即YSTR 和Y-SNP，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中應(yīng)用最為廣泛，如性別鑒定、混合斑檢測(cè)、親緣關(guān)系鑒定、家系排查及種族推斷等[2]。在Y染色體上，多個(gè)連鎖的STR和（或）SNP等位基因排列組合形成單倍型（haplotype），一組同源的單倍型則構(gòu)成單倍群（haplogroup）[3]。

Y-STR 從其發(fā)現(xiàn)到應(yīng)用經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的過(guò)程：ARNEMANN 等[4]于1986 年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)可變重復(fù)序列為[TAGA]n的Y-STR（后命名為DYS19）；ROEWER等[5]在1992 年出具了一份有關(guān)DYS19的報(bào)告，標(biāo)志著Y-STR 開(kāi)始應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)；直到2004 年，Y-STR 在法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用才得到廣泛認(rèn)可。我國(guó)法醫(yī)學(xué)界也對(duì)Y-STR 展開(kāi)了積極的研究與應(yīng)用，在2005 年已有報(bào)道稱將Y-STR 家系分型方法應(yīng)用于偵破強(qiáng)奸殺人案[6]。此后許多案件的偵破都有賴于Y-STR 的參與[7]，因此建設(shè)法庭科學(xué)Y-STR 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于輔助案件偵破具有重大意義[8]。需要指出的是，相同的單倍型由同一父系家族中的所有男性共享，這導(dǎo)致YSTR 分型檢測(cè)結(jié)果不唯一，其價(jià)值在于排除而不能認(rèn)定，更無(wú)法精準(zhǔn)識(shí)別個(gè)體[9]。針對(duì)這一局限性，學(xué)者們提出了快速突變Y-STR、低突變率Y-STR[8]等概念，有助于區(qū)分同一父系的不同個(gè)體或提高系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分辨率等法醫(yī)學(xué)實(shí)踐[10-13]。

Y-SNP 在法醫(yī)學(xué)中可作為Y-STR 的補(bǔ)充工具而發(fā)揮作用，并參與Y 染色體單倍群進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建[14]，因此近年來(lái)備受法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域?qū)W者關(guān)注。第一個(gè)Y-SNP 基因座于1994 年由SEIELSTAD 等[15]發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。相比于Y-STR，Y-SNP 的突變率更低，在遺傳過(guò)程中更穩(wěn)定，是推斷父系地理祖先的理想標(biāo)記[8]。在某些復(fù)雜的親權(quán)鑒定中，如缺少其他親屬參與的祖父-孫子親緣關(guān)系鑒定、男性個(gè)體間全同胞（半同胞）關(guān)系鑒定、叔-侄關(guān)系鑒定等，如果Y-SNP 分型檢測(cè)結(jié)果不一致，可直接判定被鑒定人間不具有上述關(guān)系[16]。然而，Y-SNP 屬于Y 染色體二等位遺傳標(biāo)記，即1 個(gè)標(biāo)記通常只有2 個(gè)等位基因，所含遺傳信息有限，這就意味著需要檢測(cè)大量的Y-SNP 位點(diǎn)才能獲得較高水平的識(shí)別率，因此Y-SNP 較少單獨(dú)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢案[17]。

1.2 NGS技術(shù)及其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

NGS，也被稱為大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel sequencing，MPS）[18]，可以同時(shí)完成多個(gè)樣本和（或）多種遺傳標(biāo)記的并行檢測(cè)，節(jié)約檢測(cè)樣本量和檢測(cè)時(shí)間，并可在合成測(cè)序模板互補(bǔ)鏈的同時(shí)讀取序列數(shù)據(jù)[19]。NGS 技術(shù)的出現(xiàn)推動(dòng)了相應(yīng)測(cè)序平臺(tái)的發(fā)展[20]，目前法醫(yī)應(yīng)用較為成熟的NGS 測(cè)序平臺(tái)主要有美國(guó)Illumina公司的Miseq FGxTM系統(tǒng)[21]和美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司的Ion TorrentTM半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)（如Ion S5TM[22]）。Miseq FGxTM系統(tǒng)測(cè)序流程通過(guò)DNA片段化、末端補(bǔ)平、加A尾以及加測(cè)序?qū)Ｓ媒宇^等步驟構(gòu)建可供上機(jī)的DNA 文庫(kù)；再經(jīng)過(guò)橋式擴(kuò)增（bridge amplification）反應(yīng)形成簇，從而放大測(cè)序熒光信號(hào)；運(yùn)用邊合成邊測(cè)序的技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，帶有熒光基團(tuán)和阻斷基團(tuán)的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）與序列結(jié)合，釋放相應(yīng)堿基的熒光信號(hào)，測(cè)序儀通過(guò)捕獲熒光信號(hào)從而進(jìn)行檢測(cè)[23]。而Ion TorrentTM半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)同樣采取邊合成邊測(cè)序的策略，區(qū)別在于使用的接頭序列不同、采用乳化PCR 而非橋式擴(kuò)增；此外，它不需要依賴光學(xué)系統(tǒng)記錄結(jié)果，而是在dNTP 和DNA 模板結(jié)合釋放出H+后，通過(guò)半導(dǎo)體傳感器記錄反應(yīng)體系的局部pH 值變化，并以此來(lái)判斷核苷酸類型[24]。

應(yīng)用NGS 技術(shù)對(duì)STR 進(jìn)行檢測(cè)，可獲得全解析度STR 基因座信息，大幅度提高STR 基因座的多態(tài)性，獲得更高的個(gè)體識(shí)別效率。同一STR 基因座中核心序列可能既存在長(zhǎng)度差異也存在序列差異，當(dāng)基序出現(xiàn)變異或重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)改變時(shí)，基因座的序列信息不同，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度卻不會(huì)發(fā)生改變。利用傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)-毛細(xì)管電泳（polymerase chain reaction-capillary electrophoresis，PCR-CE）技術(shù)檢測(cè)包含此類變異的STR 基因座，由于僅針對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度進(jìn)行區(qū)分，因此會(huì)出現(xiàn)相同的檢測(cè)結(jié)果，而使用NGS 技術(shù)檢測(cè)STR 基因座能夠清晰地分辨基因座中序列信息的差異[25]。如WANG 等[26]報(bào)道，在D12S319基因座觀察到等位基因“21”存在6 種NGS-STR 序列，而CE 技術(shù)僅能依據(jù)長(zhǎng)度檢測(cè)到等位基因“21”。此外，當(dāng)側(cè)翼序列存在SNP 位點(diǎn)或InDel 位點(diǎn)時(shí)，NGS檢測(cè)將獲得更多等位基因及其序列信息，從而增加STR 基因座遺傳信息含量。

NGS 技術(shù)應(yīng)用于微量、降解或混合物等疑難檢材分型的優(yōu)勢(shì)也十分顯著。從微量生物檢材中可提取的DNA 量通常偏低，應(yīng)用CE 技術(shù)無(wú)法達(dá)到最佳檢驗(yàn)要求，而應(yīng)用NGS 技術(shù)則能夠獲得更多的基因分型結(jié)果[27-28]。對(duì)于陳舊的骨骼、牙齒以及腐敗的組織等降解檢材，由于模板DNA 高度碎片化，應(yīng)用CE-STR試劑盒進(jìn)行DNA 分型時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)“優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增”或者“無(wú)效擴(kuò)增”，而NGS 的擴(kuò)增子長(zhǎng)度不受CE 熒光染料的限制，提高了降解檢材STR 基因座的檢出率[29-30]，并通過(guò)增加STR 基因座進(jìn)一步提高個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的證據(jù)強(qiáng)度。此外，NGS 技術(shù)可以獲得相同長(zhǎng)度等位基因間的序列差異信息，提高識(shí)別能力，使混合樣本的分析更加簡(jiǎn)便高效[31-33]。

2 基于NGS Y-STR 的檢測(cè)

NGS 技術(shù)針對(duì)STR 基因座的檢測(cè)具有諸多優(yōu)勢(shì)，由此催生出許多商業(yè)化NGS-STR 試劑盒。由于YSTR 呈父系遺傳的特點(diǎn)，其在與男性相關(guān)的法醫(yī)學(xué)案件實(shí)踐中具有重要意義，所以不乏試劑盒中涵蓋一定數(shù)目的Y-STR 基因座。美國(guó)Illumina 公司推出的ForenseqTMDNA Signature Prep 試劑盒是第一個(gè)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的同時(shí)包含STR 和SNP 的試劑盒[34]，也是目前基于Miseq FGxTM系統(tǒng)最成熟的商品化試劑盒[35]。該試劑盒共包含58 個(gè)STR 基因座（27 個(gè)A-STR、7 個(gè)XSTR 和24 個(gè)Y-STR）以及172 個(gè)SNP 標(biāo)記（94 個(gè)個(gè)體信息SNP、56 個(gè)祖先信息SNP 和22 個(gè)表型信息SNP）。CHURCHILL 等[36]在2016 年對(duì)該試劑盒的測(cè)試版本進(jìn)行了評(píng)估，除DYS392基因座由于覆蓋深度過(guò)低導(dǎo)致3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中的2 次結(jié)果不能確定外，其余YSTR 基因座的NGS 分型結(jié)果與CE 結(jié)果完全一致；DYS456基因座性能較差（序列覆蓋率＜0.6），可能出現(xiàn)等位基因丟失或?qū)y(cè)序錯(cuò)誤結(jié)果誤判為基因突變的現(xiàn)象，因此該基因座在正式版本中被剔除。GUO等[37]對(duì)正式版的試劑盒進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)以200 pg DNA 即可獲得全部的SNP 分型圖譜，100 pg 可獲得全部的STR 分型圖譜，但其認(rèn)為一些性能不佳的Y-STR基因座（如DYS392、DYS481和DYS612等）有待優(yōu)化；這與MORENO等[38]的報(bào)道類似，其在DYS392和DYS385兩個(gè)基因座上觀察到等位基因不平衡、部分或全部缺失的現(xiàn)象。國(guó)內(nèi)有研究者[39]使用該試劑盒對(duì)108 名云南苗族個(gè)體進(jìn)行測(cè)序以研究其序列多態(tài)性，結(jié)果從所測(cè)個(gè)體中檢出了106 種Y-STR 單倍型，在24 個(gè)YSTR 基 因 座 上 共 檢 出204 個(gè) 基 因，在7 個(gè)Y-STR 基 因座（DYF387S1、DYS390、DYS389Ⅱ、DYS437、DYS438、DYS448、DYS612）上的等位基因存在片段長(zhǎng)度相同而序列不同的情況。這些針對(duì)ForenseqTMDNA Signature Prep 試劑盒的研究均證明了其包含的24 個(gè)YSTR 基因座在法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用價(jià)值。另外，美國(guó)Promega 公司也基于Miseq FGxTM系統(tǒng)推出了PowerSeqTM系列試劑盒，其中PowerSeqTMAuto/Y System 試劑盒共包含22 個(gè)A-STR 基因座、1 個(gè)性別標(biāo)記Amelogenin和23個(gè)Y-STR基因座。SILVA等[40]對(duì)該試劑盒進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)基于Y-STR 序列信息的等位基因數(shù)目多于基于其長(zhǎng)度的等位基因數(shù)目（13.8%），且根據(jù)序列進(jìn)行等位基因分析時(shí)，可獲得更高的雜合度、多態(tài)信息含量和遺傳多樣性等。PowerSeqTMAuto/Mito/Y System 試劑盒是在PowerSeqTMAuto/Y System試劑盒的基礎(chǔ)上增加了10 個(gè)線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）基因座，在應(yīng)用該試劑盒對(duì)YSTR 基因座進(jìn)行分型檢測(cè)時(shí)，同樣可以增加等位基因多樣性，從而增加單倍型多樣性[41]。

除商業(yè)化試劑盒外，一些法醫(yī)學(xué)者也圍繞感興趣的Y-STR 基因座展開(kāi)了研究。由于Y 染色體上存在回文區(qū)域，Y-STR 相比A-STR 結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。某些Y-STR 基因座在染色體上存在多個(gè)拷貝，在使用特異性引物擴(kuò)增時(shí)會(huì)產(chǎn)生多個(gè)PCR 產(chǎn)物，可能會(huì)被錯(cuò)認(rèn)為是單倍型上的不同基因座，通過(guò)NGS 技術(shù)可以從序列多態(tài)性角度獲得更為詳細(xì)準(zhǔn)確的Y-STR 序列信息和分型結(jié)果。安雷雷等[42]初步建立了基于NGS技術(shù)的Y 染色體多拷貝STR 基因座（DYF404S1）分型方法，有3 例樣本可能由于Y 染色體上發(fā)生重組[43]而出現(xiàn)三等位基因的異常分型；225 例樣本中除5 例由于擴(kuò)增不均衡導(dǎo)致分型失敗外，其余樣本均得到正確分型結(jié)果。另有部分學(xué)者自主構(gòu)建了基于NGS 平臺(tái)的Y-STR 檢測(cè)體系：ZHAO 等[44]構(gòu)建了一個(gè)包含13 個(gè)Y-STR 基因座（DYS19、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS635、GATA-H4）的檢測(cè)體系，并應(yīng)用Ion TorrentTM半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證評(píng)估。該研究中除了DYS389Ⅱ的擴(kuò)增子相對(duì)較長(zhǎng)而導(dǎo)致其檢測(cè)失敗率達(dá)到1.8%外，其他所有基因座均被成功檢出。由于存在序列組成差異，在DYS389Ⅱ、DYS390、DYS437、DYS448和DYS6355 個(gè)基因座上分別觀察到7、3、2、6 和5 個(gè)新等位基因，在DYS438由于發(fā)生堿基置換而觀察到了1 個(gè)新等位基因，核心重復(fù)序列上游有4 bp 堿基缺失，導(dǎo)致DYS390的1 個(gè)等位基因與CE 檢測(cè)的分型結(jié)果不一致。KWON 等[45]構(gòu)建了1 個(gè)包含23 個(gè)Y-STR 基因座（DYS19、DYS385a/b、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS549、DYS570、DYS576、DYS635、DYS643和YGATAH4）的 檢測(cè)體系，并使用Miseq FGxTM系統(tǒng)對(duì)250 名韓國(guó)無(wú)關(guān)男性個(gè)體樣本進(jìn)行測(cè)序。研究通過(guò)對(duì)比基于NGS 與CE 得到的分型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CE 方法檢測(cè)到的基因多樣性較低的Y-STR位點(diǎn)，可能通過(guò)NGS 方法顯示出更高的等位基因多樣性；借助于類似的多重分析系統(tǒng)，法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室可獲得大量的Y-STR 重復(fù)序列信息和側(cè)翼序列信息；研究還報(bào)道了該體系的stutter 峰和信噪比，為分析低拷貝數(shù)和混合DNA 樣本的等位基因提供了有效的信息。上述研究證明，基于NGS 平臺(tái)的檢測(cè)體系將有助于在法醫(yī)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)Y-STR 的應(yīng)用。

3 基于NGS Y-SNP 的檢測(cè)

由于從點(diǎn)樣到分型均可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)一直被認(rèn)為是一種較理想的中高通量Y-SNP 檢測(cè)技術(shù)，法醫(yī)學(xué)者們也圍繞這一技術(shù)展開(kāi)了相關(guān)研究[46-48]。但質(zhì)譜技術(shù)對(duì)組織樣本的分型效果較差，且所需樣本量較高，因此在大規(guī)模應(yīng)用中存在一定的局限性。Ion TorrentTM半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)等NGS 平臺(tái)被引入法醫(yī)遺傳學(xué)領(lǐng)域后，由于其操作簡(jiǎn)便、節(jié)約成本、高靈敏度及高精確度等優(yōu)勢(shì)，為SNP 的分型檢測(cè)帶來(lái)了新方向和新思路[49]。現(xiàn)已有生物公司基于各NGS 平臺(tái)開(kāi)發(fā)出了專門針對(duì)法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的商品化SNP 檢測(cè)試劑盒。例如，美國(guó)Thermo Fisher 公司基于Ion TorrentTM半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)開(kāi)發(fā)的HID-Ion AmpliSeq Identity Panel，是該平臺(tái)第一個(gè)商業(yè)化的SNP 檢測(cè)試劑盒，共 包含90 個(gè)A-SNP 和34 個(gè)Y-SNP。EDUARDOFF 等[50]對(duì)該試劑盒的測(cè)試版本進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)25～100 pg 的DNA 可獲得90%～95%的SNP 分型；5 個(gè)SNP 標(biāo)記（rs2032597、rs2399332、rs1979255、rs1004357、rs938283）檢測(cè)到分型不一致現(xiàn)象，在試劑盒的正式版中剔除了這些標(biāo)記[51]；由于測(cè)序深度不足或分析參數(shù)設(shè)置不當(dāng)?shù)仍?，? 個(gè)SNP 位點(diǎn)觀察到信號(hào)丟失。OCHIAI 等[52]針對(duì)HIDIon AmpliSeq Identity Panel 的研究表明，與Sanger 測(cè)序相比，NGS 測(cè)序可以通過(guò)更簡(jiǎn)便的步驟提供更全面的Y-SNP 分型，而且這種工具還可用于不同人群的親子鑒定或個(gè)人識(shí)別[53]。劉浩等[54]使用該試劑盒對(duì)降解檢材進(jìn)行了檢測(cè)，平均檢測(cè)成功率82.7%，平均雜合子均衡性74.8%，相較于CE差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

國(guó)內(nèi)外另一大研究熱點(diǎn)是基于NGS 平臺(tái)自主構(gòu)建Y-SNP 遺傳標(biāo)記檢測(cè)體系，對(duì)深部序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并對(duì)體系的分型能力進(jìn)行驗(yàn)證。RALF 等[55]使用Ion TorrentTM半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)對(duì)530 個(gè)Y-SNP 進(jìn)行并行測(cè)序分型，該體系涵蓋了整個(gè)Y 染色體遺傳發(fā)育樹(shù)的分支，從而可最大程度獲得父系譜系分類。GAO等[56]利用Ion TorrentTM半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建了包含74 個(gè)Y-SNP 標(biāo)記的檢測(cè)體系，對(duì)100 個(gè)四川漢族樣本進(jìn)行分析后將其分為18 個(gè)單倍群，并據(jù)此繪制了新的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。這種新的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)幾乎覆蓋了中國(guó)所有的Y 單倍群，因此可以用來(lái)準(zhǔn)確定位任意中國(guó)男性在系譜中的位置。WANG 等[57]設(shè)計(jì)了一個(gè)包含165 個(gè)Y-SNP 位點(diǎn)的NGS 檢測(cè) 體系，并依據(jù)54 名無(wú)關(guān)男性個(gè)體樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)分析評(píng)估體系的測(cè)序性能，研究發(fā)現(xiàn)，除9 個(gè)性能較差的Y-SNP（4 個(gè)覆蓋度過(guò)低，5 個(gè)背景噪聲較高）以外，其余標(biāo)記表現(xiàn)良好，并且可達(dá)到較高的分辨率，證明了該Y-SNP 檢測(cè)系統(tǒng)可補(bǔ)充以前的檢測(cè)方法，是一種適用于中國(guó)人群進(jìn)行父系親緣關(guān)系鑒定和法醫(yī)學(xué)家系溯源的有利工具。

4 應(yīng)用與展望

NGS 技術(shù)的高速發(fā)展豐富了法醫(yī)遺傳學(xué)研究的方式，成為具有極高應(yīng)用價(jià)值的法醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)，國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者都迫切期望將這一技術(shù)的先進(jìn)成果應(yīng)用于實(shí)際案件檢驗(yàn)中。現(xiàn)已有NGS 商業(yè)化試劑盒可檢測(cè)STR 和（或）SNP，用于個(gè)體識(shí)別或親權(quán)鑒定等法醫(yī)學(xué)實(shí)務(wù)[58]。另有學(xué)者構(gòu)建了針對(duì)Y-STR 或Y-SNP的NGS 檢測(cè)體系，為進(jìn)一步將NGS 技術(shù)應(yīng)用于父系親緣關(guān)系鑒定或家系溯源等提供了理論依據(jù)[59]。此外，許多研究[60-61]還表明，Y-STR 和Y-SNP 的聯(lián)合分析不僅可用于男性的個(gè)體識(shí)別，還可用于父系生物地理譜系推斷，并且所獲得的Y-STR 和Y-SNP 頻率分布對(duì)于評(píng)估中國(guó)漢族人群乃至世界男性人群分級(jí)具有重要意義。但目前，聯(lián)合應(yīng)用的主要方法為通過(guò)CE 與NGS 分型體系分別對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，將所得YSTR 和Y-SNP 數(shù)據(jù)整合后再進(jìn)行分析[62]。而隨著NGS 技術(shù)的應(yīng)用，對(duì)多種遺傳標(biāo)記進(jìn)行并行測(cè)序分析不僅可節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)也可減低樣本的損耗，因此近來(lái)亦有將Y-STR 和Y-SNP 復(fù)合擴(kuò)增后進(jìn)行并行測(cè)序的報(bào)道[63]，可能成為今后法醫(yī)學(xué)Y 染色體遺傳標(biāo)記檢測(cè)的有力技術(shù)手段。

然而，當(dāng)前法醫(yī)遺傳學(xué)界對(duì)于NGS 技術(shù)的應(yīng)用仍有大量工作有待開(kāi)展：（1）大規(guī)模并行測(cè)序的實(shí)現(xiàn)使DNA 檢測(cè)結(jié)果不再單一，而是可能涵蓋A-STR、YSTR、X-STR、線粒體DNA 信息等多種標(biāo)記類型的遺傳信息。信息量驟增的同時(shí)，數(shù)據(jù)的形式也更為復(fù)雜，因此需要數(shù)據(jù)庫(kù)擁有更強(qiáng)大的對(duì)比和存儲(chǔ)信息能力。（2）各測(cè)序平臺(tái)都有出現(xiàn)測(cè)序錯(cuò)誤的概率，因此研制并完善操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、分析快速的測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)于NGS 數(shù)據(jù)的使用具有重要意義。此外，綜合分析所有遺傳標(biāo)記及其側(cè)翼區(qū)信息并實(shí)現(xiàn)NGS 數(shù)據(jù)與現(xiàn)有大量CE 數(shù)據(jù)的一致性和兼容性也是亟待解決的問(wèn)題。我國(guó)在制定NGS 數(shù)據(jù)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方面也仍處于探索階段，不同實(shí)驗(yàn)室不同平臺(tái)的等位基因命名規(guī)則、檢測(cè)結(jié)果解讀需要統(tǒng)一，以便后續(xù)實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享。同時(shí)，我國(guó)需要研發(fā)適合中國(guó)人群的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的NGS Y-STR（SNP）檢測(cè)試劑盒，以期發(fā)現(xiàn)新的等位基因，積累各民族、各地域人群的等位基因頻率并擴(kuò)充Y 染色體DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)。