王志鵬,尹晶晶,許文黎,孫鴿,高潔,張偉,秦秀軍,李建國(guó),劉歡

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院藥物安全性評(píng)價(jià)中心，太原，030006)

原發(fā)性肝癌(PLC)是一種最常見(jiàn)的惡性腫瘤，我國(guó)每年有約13萬(wàn)人死于原發(fā)性肝癌[1]。目前肝癌的臨床治療主要包括手術(shù)切除、放療、化療、靶向治療等。近年來(lái)，放療栓塞治療(TARE)，因其能夠?qū)⒎派湫运幬锞珳?zhǔn)栓塞于腫瘤部位，成為臨床應(yīng)用研究的熱點(diǎn)[2]。但是相關(guān)療法和藥物的研發(fā)，需要類似人肝癌轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型和相關(guān)介入療法的臨床前試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其安全性和有效性。VX2兔肝癌原位模型是迄今為止唯一能夠在較大動(dòng)物建立的肝轉(zhuǎn)移性腫瘤模型，該模型多用于肝臟腫瘤的影像學(xué)和治療學(xué)研究[3-6]。該模型腫瘤發(fā)展過(guò)程與人肝癌相似，是最理想的肝癌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在該模型上開(kāi)發(fā)出的藥物和療法對(duì)指導(dǎo)臨床選擇腫瘤治療方案有重大意義。目前臨床上介入手術(shù)相當(dāng)成熟，且主要集中于栓塞治療，但目前我國(guó)仍然沒(méi)有TARE相關(guān)藥物，缺乏TARE臨床經(jīng)驗(yàn)，因此對(duì)于VX2兔肝癌原位模型進(jìn)行TARE的方法建立尤為重要，能夠?yàn)榕R床治療提供重要參考價(jià)值[7]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔8只，雌雄各半；5～6月齡，北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng) SCXK(京)2016-0007；兔VX2肝癌瘤塊來(lái)源于東南大學(xué)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)輻射防護(hù)研究院放射性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施普通環(huán)境，單籠飼養(yǎng)SYXK(晉)2019-0002，輻射安全許可證號(hào)：國(guó)環(huán)輻證(00346)。

1.2 主要儀器和試劑

鹽酸利多卡因注射液，山東華魯制藥有限公司；眼科剪，揚(yáng)州市華宏醫(yī)療器械有限公司；GE Light Speed 64層螺旋CT掃描儀，美國(guó) GE公司；碘帕醇注射液，上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司；肝素鈉注射液，天津生物化學(xué)制藥有限公司；DSA，美國(guó) GE公司。放射性90Y微球，按照全肝吸收劑量100 Gy進(jìn)行給藥，90Y為理想的治療用放射性核素，半衰期為64 h，釋放純?chǔ)螺椛?2.288 MeV)。目前上市的90Y 微球主要有90Y-玻璃微球和90Y-樹(shù)脂微球，臨床用于治療晚期肝癌，給藥途徑為肝動(dòng)脈介入給藥[8]。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 兔VX2肝癌模型建立

將瘤塊于37 ℃下解凍，先將瘤塊上的壞死組織和肌肉組織去除，然后將瘤塊上的魚肉樣組織剪碎成大小約為1～2 mm3小塊，將其浸泡在無(wú)菌鹽水中，用注射器抽取瘤塊。

采用開(kāi)腹直視下瘤組織塊穿刺注入法接種。實(shí)驗(yàn)兔接種前12小時(shí)禁食但不禁水，術(shù)前給予兔戊巴比妥鈉麻醉，在以標(biāo)準(zhǔn)外科方式準(zhǔn)備和覆蓋腹部后，用小刀片做垂直方向的劍突下小切口，并使用鈍性剝離通過(guò)無(wú)血管白線暴露腹膜，仔細(xì)劃分腹膜可以看到肝臟，逐層入腹，暴露肝臟下緣。使用擴(kuò)開(kāi)器將切口擴(kuò)開(kāi)，動(dòng)作溫和的將暴露肝臟內(nèi)側(cè)段和外側(cè)段拉出體外，注意避免肝包膜撕裂，暴露的器官應(yīng)用濕紗布保持濕潤(rùn)。將含有瘤塊的注射器換用18G穿刺針斜穿刺入肝左葉，注射瘤塊混合液0.1 mL，隨后迅速拔出穿刺針，穿刺點(diǎn)滲出的少量血用無(wú)菌棉簽壓迫止血。將肝臟左頁(yè)放回體內(nèi)后，逐層縫合腹膜、肌肉、皮膚?？p合后在皮膚創(chuàng)口處涂撒少量注射青霉素粉針劑。術(shù)后連續(xù)4天在實(shí)驗(yàn)兔大腿外側(cè)肌群注射青霉素，并用碘伏擦拭手術(shù)創(chuàng)口來(lái)預(yù)防感染。

2.2 CT腫瘤觀察

接種后14天，將動(dòng)物麻醉后置于螺旋CT下進(jìn)行胸腹部掃描。CT參數(shù)為管電壓 80 kV，管電流 60 mA。先平掃定位，后序貫動(dòng)態(tài)三期增強(qiáng)掃描，采集時(shí)間分別為動(dòng)脈期(15 s)、靜脈期(25 s)和延遲期(45 s)。

2.3 VX2兔肝癌原位模型介入給予放射性微球

隨機(jī)選取4只動(dòng)物開(kāi)展介入給予放射性微球試驗(yàn)。將模型兔麻醉后，平躺體位將四肢拉直，將動(dòng)物固定于手術(shù)臺(tái)，先用手觸摸找出股動(dòng)脈位置，再用手術(shù)刀逐層切開(kāi)皮膚，分離出股動(dòng)脈；用穿刺針穿刺股動(dòng)脈，并置入5F動(dòng)脈鞘后立即插入2.7F微導(dǎo)管避免動(dòng)物失血，用手術(shù)縫合線將血管鞘與股動(dòng)脈結(jié)扎固定。操作導(dǎo)絲末端手柄將導(dǎo)管導(dǎo)絲送至肝總動(dòng)脈。于DSA儀器下進(jìn)行碘帕醇注射液造影，確認(rèn)微導(dǎo)管位置是否在肝總動(dòng)脈，并確認(rèn)附近血管走形找出肝固有動(dòng)脈的位置；之后繼續(xù)操作微導(dǎo)絲上行至肝固有動(dòng)脈，進(jìn)行碘帕醇注射液造影，確認(rèn)肝臟輪廓和腫瘤輪廓。

上述操作確認(rèn)微導(dǎo)管行至肝固有動(dòng)脈后，將導(dǎo)管位置固定，使用三通連接器連接裝有放射性微球的注射器、裝有生理鹽水的注射器和微導(dǎo)管，緩慢推注給藥。裝有放射性微球的注射器裝入注射器鉛防護(hù)套。給藥后用三通連接器連接的生理鹽水沖洗微導(dǎo)管。給藥后再次使用碘帕醇注射液造影，觀察肝臟和腫瘤血管栓塞情況。上述操作結(jié)束后拔出微導(dǎo)管和血管鞘，將股動(dòng)脈穿刺位置前后1 cm處結(jié)扎，結(jié)扎股動(dòng)脈穿刺位置，逐層縫合肌肉、皮膚?？p合后在皮膚創(chuàng)口處涂撒少量注射青霉素粉針劑。術(shù)后連續(xù)4天在實(shí)驗(yàn)兔大腿外側(cè)肌群注射青霉素，并用碘伏擦拭手術(shù)創(chuàng)口來(lái)預(yù)防感染。

3 結(jié)果

3.1 VX2兔肝癌原位模型構(gòu)建及生長(zhǎng)情況

動(dòng)物接種試驗(yàn)后，有3只動(dòng)物出現(xiàn)傷口發(fā)炎情況，14天后CT檢查時(shí)可見(jiàn)所有動(dòng)物肝臟部位均有低密度結(jié)節(jié)，判斷為腫瘤，腫瘤平均直徑為1.2 cm。CT結(jié)果表明，VX2兔肝癌原位模型構(gòu)建成功，且成功率達(dá)100%。

未進(jìn)行介入給予放射性微球的4只荷瘤兔于瘤塊種植后30天解剖檢查，可見(jiàn)肝臟腫瘤接種部位有直徑較大的實(shí)質(zhì)腫物，同葉肝臟有多處轉(zhuǎn)移灶，在肝臟網(wǎng)膜、腹壁開(kāi)腹部位、肺臟可見(jiàn)多處轉(zhuǎn)移病灶。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所用方法構(gòu)建的VX2兔肝癌原位模型成功，且成功率達(dá)100%，未見(jiàn)動(dòng)物因感染和手術(shù)因素死亡。

3.2 VX2兔肝癌原位模型介入給予放射性微球

VX2兔肝癌原位模型腫瘤為富血管瘤，經(jīng)DSA下造影檢查，可見(jiàn)肝臟部位清晰的腫瘤輪廓為球狀，且其中血管極其豐富。在肝總動(dòng)脈入口進(jìn)行碘帕醇造影，可見(jiàn)在腹腔干動(dòng)脈上的主要血管走形，在分支中較細(xì)的一支行向左下為脾動(dòng)脈，胃左和肝總動(dòng)脈共行一段，之后胃左動(dòng)脈行于胃小彎，肝總動(dòng)脈向右上走行；肝總動(dòng)脈之后分出胃十二指腸動(dòng)脈和肝固有動(dòng)脈，微導(dǎo)管行至此肝固有動(dòng)脈(即供養(yǎng)肝臟腫瘤的血管)，再次使用碘帕醇造影檢查，可見(jiàn)血管顯象出肝臟輪廓，且腫瘤清晰可見(jiàn)，將導(dǎo)管位置固定后使用三通連接器連接裝有放射性藥物的注射器、裝有生理鹽水的注射器和微導(dǎo)管，緩慢推注給藥。給藥后再次造影，可以看到之前清晰的腫瘤輪廓變成只有外周一圈的輪廓，內(nèi)部不可見(jiàn)豐富的血管，表明藥物進(jìn)入腫瘤組織，且將腫瘤內(nèi)部血管栓塞，表明給藥成功。

將試驗(yàn)動(dòng)物于給藥后16天解剖檢查，可見(jiàn)動(dòng)物肝臟腫瘤接種位置有直徑較大實(shí)質(zhì)腫物，但同葉肝臟、肺臟均無(wú)轉(zhuǎn)移灶，在肝臟網(wǎng)膜可見(jiàn)少許轉(zhuǎn)移病灶。

4 放射微球介入試驗(yàn)操作中的輻射防護(hù)策略

因?yàn)樗幬锞哂蟹派湫郧褼SA機(jī)器亦通過(guò)釋放X射線進(jìn)行顯像，因此在整個(gè)給藥過(guò)程中操作人員的受照劑量會(huì)很高，在相關(guān)操作中應(yīng)注意人員防護(hù)，采取屏蔽防護(hù)、時(shí)間防護(hù)、距離防護(hù)相結(jié)合的方式，最大可能保護(hù)操作人員。

屏蔽防護(hù)：在DSA機(jī)器球管與介入手術(shù)操作人員之間增加10 mm的鉛防護(hù)，在動(dòng)物固定臺(tái)于動(dòng)物下腹部部位增加3 mm的鉛防護(hù)，人員穿戴鉛防護(hù)服(0.5 mm Pb)，穿戴鉛防護(hù)手套(0.02 mm Pb)，佩戴鉛眼鏡(0.5 mm Pb)。

時(shí)間防護(hù)：熱藥試驗(yàn)前先進(jìn)行冷藥的模擬試驗(yàn)，使各崗位人員能熟練操作縮短操作時(shí)間，熱藥試驗(yàn)時(shí)將各個(gè)環(huán)節(jié)分解為流水線操作，保證人員接觸放射性藥物時(shí)間最短化，在介入手術(shù)和給藥環(huán)節(jié)進(jìn)行人員輪崗工作，每人一只。

距離防護(hù)：人員在給藥后進(jìn)行縫合、清創(chuàng)、觀察、清潔等操作時(shí)進(jìn)行鉛簾(0.5 mm Pb)屏蔽，并保持一定距離，飼養(yǎng)期間動(dòng)物個(gè)體之間保持大于2 m的距離。上述試驗(yàn)的注意事項(xiàng)以及相關(guān)防護(hù)措施能夠?yàn)槲覈?guó)非臨床TARE的相關(guān)藥效學(xué)和毒理學(xué)試驗(yàn)操作提供一些經(jīng)驗(yàn)和建議。

5 討論

為了確保VX2兔肝癌原位模型成功建立，需要注意以下幾點(diǎn)：(1)選取靠近腫瘤邊緣生長(zhǎng)旺盛的質(zhì)嫩灰白色魚肉樣組織進(jìn)行移植，能夠相應(yīng)的提高腫瘤細(xì)胞的成活率；(2)建模前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行禁食，可以減小實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道返流，避免不必要的不良反應(yīng)；(3)于肝左葉進(jìn)行腫瘤組織植入，肝左葉血液豐富體積較大，有利于腫瘤組織生長(zhǎng)。

肝動(dòng)脈介入試驗(yàn)操作中需要注意：(1)為減小試驗(yàn)人員受照劑量，采取雙人配合操作，需先進(jìn)行模擬訓(xùn)練，提高配合默契度，提高操作成功率；(2)造影找到肝固有動(dòng)脈后，盡量繼續(xù)上行導(dǎo)絲導(dǎo)管至肝左動(dòng)脈，使藥物能夠更好的富集于肝左葉腫瘤部位，但是在繼續(xù)上行過(guò)程中需要極其緩慢小心，肝左動(dòng)脈很細(xì)小稍有不慎就會(huì)引起血管破裂。

放射微球藥物給藥時(shí)注意：采用三通連接器，盡量減少不必要的污染，在微球給藥時(shí)應(yīng)將微導(dǎo)固定，避免位移，之后需要將抽好藥量的注射器進(jìn)行稀釋，避免濃度較大的微球堵塞微導(dǎo)管，在給藥后用適量生理鹽水沖洗導(dǎo)管，將微導(dǎo)管內(nèi)的殘留要物沖洗到肝臟；

放射性藥物介入操作和放射性微球給藥操作中的輻射防護(hù)策略，可以用于其他放射性藥物的非臨床研究中。