李曙芳,岳娟,許文黎,黃立群,王志鵬,孫鴿,胡波

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院GLP中心，太原，030006)

機(jī)體受到一定劑量照射后，可引起出血現(xiàn)象。出血是輻射損傷最嚴(yán)重的癥狀之一，也是導(dǎo)致機(jī)體死亡的主要原因，常表現(xiàn)為全身廣泛性小血管出血，出血原因較為復(fù)雜，其中輻射引起凝血功能障礙和微循環(huán)障礙是引起出血的重要機(jī)制之一[1-2]。照射劑量不同，會(huì)導(dǎo)致出血發(fā)生時(shí)間、出血部位、嚴(yán)重程度不同。凝血常規(guī)檢測(cè)是臨床上常用的血液學(xué)檢驗(yàn)指標(biāo)之一，主要包括凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)、D-二聚體(D-D)和纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)等，可準(zhǔn)確反映受檢者的凝血功能狀態(tài)[3]。APTT、PT分別檢測(cè)內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng), D-D和FDP則是纖維蛋白階段的檢測(cè)，可作為繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)主要實(shí)驗(yàn)指標(biāo)：D-D是一種纖維蛋白降解產(chǎn)物中的一種片段，是交聯(lián)后纖維蛋白被纖溶酶降解的特異標(biāo)志物，是確定體內(nèi)有無(wú)血栓形成及繼發(fā)性纖溶的指標(biāo)，其含量變化可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的標(biāo)志；FDP是在凝血過(guò)程中形成的纖維蛋白原被纖溶酶降解形成的纖維蛋白復(fù)合物，它是原發(fā)性纖溶亢進(jìn)標(biāo)志物。

本研究觀察比格犬受到60Co γ射線不同劑量單次全身單側(cè)照射后不同時(shí)間血小板和凝血功能指標(biāo)的變化情況，以期為輻射損傷中出血綜合癥的研究提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只健康比格犬(7.5～8.0 kg)，南京柴門生物科技有限公司[動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0007]。動(dòng)物購(gòu)回后，置于中國(guó)輻射防護(hù)研究院非嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施[合格證號(hào)：SYXX(晉)2016-0002]獨(dú)居籠養(yǎng)。

1.2 照射條件

60Co γ射線照射源，中國(guó)輻射防護(hù)研究院鈷源房，檢定證書編號(hào)：DYjl2013-3512，檢定單位:中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，檢定時(shí)間：2013年10月。

1.3 主要試劑與儀器

HEMAVET 950型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，美國(guó)DREW公司；半自動(dòng)四通道血凝儀，法國(guó)STAGO公司；Konelab Prime30全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；血細(xì)胞分析儀試劑包，美國(guó)DREW公司；活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)檢測(cè)試劑盒為上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；纖維蛋白原(FDP)、D-二聚體(D-D)檢測(cè)試劑盒為廣州科方生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動(dòng)物分組與照射

比格犬檢疫1個(gè)月后，按照體重隨機(jī)分為2 Gy照射組、3 Gy照射組和4 Gy照射組，吸收劑量分別為2 Gy、3 Gy、4 Gy，每組4只。比格犬固定后，清醒狀態(tài)下接受單次全身單側(cè)照射，照射劑量率為 50 cGy/min，源距為2.50 m。

1.4.2觀察指標(biāo)

(1)觀察動(dòng)物一般體征，記錄死亡時(shí)間。進(jìn)行大體解剖，分析死因。

(2)血小板計(jì)數(shù)：照射前及照射后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、30 d，抽取比格犬前肢靜脈血液，檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)。

(3)凝血指標(biāo)：照射前及照射后6 h、24 h、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、30 d，用檸檬酸鈉抗凝采血管抽取比格犬前肢靜脈血2 mL，經(jīng)2 500 g離心15 min分離得血漿，用于APTT、PT的檢測(cè)；用分離膠-促凝劑采血管采血 5 mL，血細(xì)胞凝集后，2 500 g離心15 min，分離得血清，用于檢測(cè)D-D和FDP。

1.4.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般體征

2 Gy照射組所有動(dòng)物均未見明顯異常，30天存活率為100%。

3 Gy照射組有1只動(dòng)物在照射后15 d精神萎靡，食欲減退，持續(xù)2天后狀態(tài)恢復(fù)，但見便血；30天存活率為100%。

4 Gy照射組照射后20 h內(nèi)1只動(dòng)物嘔吐，1只有惡心反胃；有3只動(dòng)物分別在第15、18、28天死亡，死亡動(dòng)物解剖均可見肺臟大面積出血，氣管內(nèi)有泡沫狀液體，心包、脾臟、腸系膜、直腸等局部出血。出血是動(dòng)物死亡的主要原因。

2.2 血小板計(jì)數(shù)

比格犬受照后不同時(shí)間血小板計(jì)數(shù)的變化情況列于表1。由表1可見，受照比格犬在照射后7天已有出血傾向，在照射后14天達(dá)最低值，接近極期，與動(dòng)物一般觀察結(jié)果一致。

表1 比格犬受照后不同時(shí)間血小板計(jì)數(shù)(109/L)

2.3 凝血指標(biāo)

2.3.1活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)

比格犬受照后不同時(shí)間APTT的變化情況列于表2。由表2可見，與照射前相比，照射組APTT從照射后24 h開始顯著縮短。結(jié)果說(shuō)明，受照動(dòng)物的凝血機(jī)制以內(nèi)源性凝血途徑為主。

表2 比格犬受照后不同時(shí)間APTT的變化情況(s)

2.3.2凝血酶原時(shí)間(PT)

比格犬受照后不同時(shí)間PT的變化情況列于表3。由表3可見，與照射前相比，2 Gy照射組和3 Gy照射組PT差異不顯著，4 Gy照射組照射后14 d開始顯著縮短。結(jié)果說(shuō)明，受照比格犬的外源性凝血機(jī)制啟動(dòng)較緩。

表3 比格犬受照后不同時(shí)間PT的變化情況(s)

2.3.3D-二聚體(D-D)

比格犬受照后不同時(shí)間D-D的變化情況列于表4。由表4可見，2 Gy照射組、3 Gy照射組和4 Gy照射組D-D水平分別在照后28 d、21 d和24 h顯著高于照射前，受照劑量越大，D-D水平升高的時(shí)間越早，提示機(jī)體內(nèi)血液呈高凝狀態(tài)和繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)的狀況越早。

表4 比格犬受照后不同時(shí)間D-D的變化情況(mg/L)

2.3.4纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)

比格犬受照后不同時(shí)間FDP的變化情況列于表5。由表5可見，2 Gy、3 Gy、4 Gy照射組FDP水平分別在照射后28 d、21 d和24 h顯著高于照射前，受照劑量越大，F(xiàn)DP水平升高的時(shí)間也越早，機(jī)體原發(fā)性纖溶亢進(jìn)的狀況越早。

表5 比格犬受照后不同時(shí)間FDP的變化情況(μg/mL)

3 討論

輻射引起的出血可發(fā)生在全身各部位，以點(diǎn)狀或者斑狀為主，時(shí)間以極期前最嚴(yán)重，程度與輻射劑量關(guān)系密切，由于具有此類特點(diǎn)規(guī)律，故稱之為輻射出血綜合征[2,4]，其發(fā)生機(jī)制大致有以下3個(gè)方面：血小板的數(shù)量和質(zhì)量的異常；血凝、抗凝和纖維蛋白溶解系統(tǒng)障礙；血管壁的結(jié)構(gòu)和功能異常。輻照可造成血小板降低，繼而凝血因子被激活啟動(dòng)，發(fā)生一系列的瀑布反應(yīng)：凝血酶原激活物形成、凝血酶原激活成凝血酶、纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白等，血凝和抗凝平衡被打破，可能發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血，最終形成血栓；同時(shí)血管壁細(xì)胞的損傷和血管脆性增加，也是機(jī)體在照后容易出血甚至致死的重要原因。

在本實(shí)驗(yàn)中可以看出，照射后24 h，各受照組比格犬APTT均開始下降，表明在照后早期，機(jī)體的內(nèi)源性凝血機(jī)制即啟動(dòng)，APTT是對(duì)輻射較為敏感的指標(biāo)；而血液學(xué)指標(biāo)PLT在照后7天才發(fā)生明顯的下降，提示出血狀況可能就要發(fā)生；而D-D和FDP的變化比較一致，表明受照劑量越大，出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血、栓塞的可能性越早，更易出現(xiàn)栓塞性出血疾病[5-9]。結(jié)果表明，2 Gy和4 Gy照射均可啟動(dòng)內(nèi)源性凝血機(jī)制、形成血栓繼而出現(xiàn)纖溶亢進(jìn)，而4 Gy照射引發(fā)出血死亡的機(jī)制與血凝、抗凝和纖維蛋白溶解系統(tǒng)障礙有關(guān)。

因此，在今后的輻射致出血綜合征機(jī)制及救治的研究中，在照后早期可關(guān)注內(nèi)源性出血機(jī)制，可能發(fā)現(xiàn)輻射敏感標(biāo)志物；極期前可關(guān)注凝血和抗凝平衡以及纖維蛋白降解，以研究具有針對(duì)性的預(yù)防措施或?qū)ΠY治療措施。