袁慧,劉夢雅,劉歡,李建國

(中國輻射防護研究院，山西，030006)

放射治療是宮頸癌、前列腺癌等盆腔惡性腫瘤治療的常用手段，且近年來在此類腫瘤治療中的地位日漸提高[1]。然而直腸與宮頸、膀胱等臟器的解剖位置相近，均在腹腔下部，因此在放療中或放療后, 由電離輻射導致的直腸炎是常見的并發(fā)癥之一。其發(fā)生率高達50%～70%[2]，嚴重影響治療的連續(xù)性和治療效果，有些甚至影響患者的預后及生活質(zhì)量。國內(nèi)外研究人員對放射性直腸炎(RP)的防治研究一直比較關(guān)注[3-6]，但仍未獲得突破性進展，放射性直腸炎動物模型的建立是研究中非常關(guān)鍵的步驟。確定模型建立的照射方法，制作穩(wěn)定的動物模型對節(jié)省動物資源和減少實驗消耗至關(guān)重要。本研究采用X射線單次大劑量局部照射SD大鼠，對其臨床表現(xiàn)和組織病理學的改變進行觀察，旨在探索建立大鼠放射性直腸炎模型的方法，為放射性直腸炎的治療藥物開發(fā)和評價提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠60只，體重250～280 g，北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國輻射防護研究院GLP中心，許可證號：SYXX(晉)2018—0005。

1.2 輻照源

Elekta Synergy直線加速器，X射線出束能量6 MeV，英國Elekta Limited公司生產(chǎn)，山西白求恩醫(yī)院放療科提供，由河北嘉盛劑量服務有限公司檢定，檢定有效期為2021年11月。

1.3 動物分組及照射

1.3.1動物分組

照射前將動物稱重，根據(jù)動物體重按分段均衡隨機分組法將動物進行分組。

為精確探明模型的最適劑量，本實驗進行了兩次造模，第一次劑量范圍較大，分為對照組、10 Gy照射組、15 Gy照射組、20 Gy照射組、25 Gy照射組、30 Gy照射組；第二次劑量間隔較小，分為對照組、14 Gy照射組、15 Gy照射組、16 Gy照射組、17 Gy照射組、18 Gy照射組。每組動物數(shù)均為5只，性別均為雄性。

1.3.2照射方法

將大鼠采用2.5%的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，以仰臥位局部單次大劑量照射。

第一次造模的照射范圍為大鼠下腹部，源皮距為100 cm，照射劑量率為600 MU/min，射野均勻性為3%。照射劑量為 0、10、15、20、25和30 Gy。未照射部位不采取遮擋措施。

第二次造模的照射范圍縮小為自恥骨聯(lián)合上緣至肛門，源皮距為100 cm，照射劑量率為300 MU/min，射野均勻性為3%，照射劑量為 0、14、15、16、17和18 Gy。未照射部位不采取遮擋措施。

照射結(jié)束，將照射組與空白對照組大鼠置于相同環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)14天。

1.4 觀察指標

照射后第2天開始隔日稱取動物體重、每周稱量攝食量，每日觀察動物的反應速度、活動度、排便情況、有無肛周脫毛、肛門出血和死亡等情況。

1.5 病理組織學觀察

照射后第14天將大鼠麻醉，剖取肛門以上直腸組織約3 cm，用生理鹽水沖洗，取1 cm×1 cm大小組織，以10%福爾馬林固定后石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察直腸組織病理改變。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料服從正態(tài)分布者采用單因素方差分析，如果不符合正態(tài)或方差齊性用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗分析，以p<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

第一次造模：各組照射后動物均出現(xiàn)不同程度的活動量減少，反應速度減慢；照后第3天，15 Gy照射組、20 Gy照射組、25 Gy照射組和30 Gy照射組的動物出現(xiàn)排稀便現(xiàn)象；照后第4天，20 Gy照射組、25 Gy照射組和30 Gy照射組動物均出現(xiàn)鼻腔出血現(xiàn)象。

第二次造模：各組照射后動物均出現(xiàn)不同程度的活動量減少，反應速度減慢，照射部位脫毛等現(xiàn)象。

2.2 體重

第一次造模：照射當天，動物體重組間比較差異不顯著；照后第2天至照后第12天，動物體重組間比較差異顯著，其中，10 Gy照射組在照后第2天動物體重達到最低，之后有所恢復，但與對照組各時間點體重比較仍有顯著差異。

第二次造模：照射當天，動物體重組間比較差異不顯著；照后第3天至照后第15天，各組動物體重均呈現(xiàn)不同程度的增長，但17 Gy照射組、18 Gy照射組較其他組增長幅度減小。

2.3 動物生存情況

第一次造模：照射后第4天，30 Gy照射組出現(xiàn)2只死亡動物；照后第5天，20 Gy照射組出現(xiàn)3只死亡動物，25 Gy照射組出現(xiàn)5只死亡動物；照后第6天，15 Gy照射組出現(xiàn)2只死亡動物。10 Gy照射組存活率100%；15 Gy照射組存活率40%；20 Gy、25 Gy、30 Gy照射組存活率0%，動物死亡前均出現(xiàn)背毛不齊，消瘦等癥狀。

第二次造模各組均未有動物經(jīng)照射死亡。

2.4 攝食量變化情況

第一次造模：照后第一周，除對照組正常攝食外，其余照射組均未攝食；第二周，存活動物恢復攝食，與對照組比較，10 Gy照射組攝食量差異不顯著，15 Gy照射組攝食量顯著減少。

第二次造模：照后第二周，除對照組正常攝食外，其余照射組均較第一周攝食量減少。

2.5 病理組織學形態(tài)觀察

第一次造模：從外觀看，照射部位均出現(xiàn)不同程度的背毛脫落現(xiàn)象，與對照組比較照射組存活動物腸充血較明顯；通過對直腸進行HE染色，在200倍光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)黏膜柱狀上皮、固有層大腸腺、黏膜肌層、黏膜下層、肌層以及外膜均未見異常。

第二次造模：從外觀看，照射部位均出現(xiàn)不同程度的背毛脫落現(xiàn)象；通過對直腸進行HE染色，在200倍光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，14 Gy照射組、15 Gy照射組、16 Gy照射組、17 Gy照射組和18 Gy照射組動物盲腸、結(jié)腸的粘膜均出現(xiàn)輕微/輕度炎細胞浸潤；15 Gy照射組、16 Gy照射組、17 Gy照射組和18 Gy照射組動物直腸的粘膜均出現(xiàn)輕微/輕度炎細胞浸潤，部分動物出現(xiàn)粘膜水腫，其中，17 Gy照射組和18 Gy照射組病變程度略重，其余各組病變程度未見明顯差異。

3 討論

本實驗通過對兩次造模的數(shù)據(jù)分析認為，照射時的照射野范圍和劑量率與造模結(jié)果有很大關(guān)聯(lián)。扈婷婷等[2]將雄性 Wistar 大鼠采用直線加速器單次盆腔局部照射的方法進行照射，不用鉛塊遮擋，照射野面積為3.5 cm×5 cm，源皮距100 cm，劑量率為300 cGy/min，認為19～21.5 Gy能成功誘導大鼠急性放射性直腸炎。徐偉等[3]選用SD大鼠采用與扈婷婷同樣的照射方法，照射野面積5 cm×8 cm，周圍以厚鉛塊屏蔽，認為12 Gy為放射性直腸炎模型成功的劑量。李宜放等[7]選擇 Wistar大鼠，照射野面積3 cm×4 cm, 其余部位以厚鉛塊屏蔽，源皮距80 cm，劑量率300 cGy/min，確立最佳照射劑量為20 Gy。Seunghee等[4]的研究發(fā)現(xiàn)下腹部照射 17.5 Gy可引起大鼠輕中度直腸炎，Korkut等[4]的研究用 20 Gy 建立了大鼠中重度模型，Northway等[5]的研究表明，照射20 Gy或更高劑量，可引起大鼠直腸較嚴重的損傷。綜合國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，大鼠造模成功的劑量不盡相同，可能與大鼠體質(zhì)量、品種和照射方法等相關(guān)聯(lián)[8]。扈婷婷[2]等認為，照射方法對實驗結(jié)果的影響很大。

本實驗綜合成活率和RP的組織病理學表現(xiàn)，第一次造模結(jié)果中，15 Gy能保證一定的成活率但病理學改變程度輕微。因此第二次造模時盡量避免對小腸的照射，同時降低劑量率，提高照射劑量，在保證存活率的前提下增加對直腸的損傷程度。結(jié)果顯示照射后各組動物體重呈不同程度的增長，其中18 Gy組的增長幅度減小，各照射組的攝食量出現(xiàn)減少，未有動物經(jīng)照射死亡，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，5個照射組動物盲腸、結(jié)腸的粘膜均出現(xiàn)輕微/輕度炎細胞浸潤；除14 Gy組，其余照射組動物直腸的粘膜均出現(xiàn)輕微/輕度炎細胞浸潤，部分動物出現(xiàn)粘膜水腫，其中，17 Gy照射組和18 Gy照射組病變程度略重。因此認為18 Gy 在保證了大鼠生存率的前提下使大鼠直腸組織病理學發(fā)生改變，這個劑量可視為放射性直腸炎模型的造模成功劑量，有望為今后進一步研究奠定基礎(chǔ)。