李 露 何 芬 楊鳳武 古 靜 徐亞麗

近年來(lái)，干細(xì)胞療法作為新型治療手段逐漸應(yīng)用于多種疾病。其中，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由于其取材較為容易、免疫原性較弱且具有分化為多種細(xì)胞的能力，成為研究的熱點(diǎn)之一［1］，其治療效果與移植入體內(nèi)后到達(dá)靶組織的效率密切相關(guān)。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是最重要的趨化與歸巢相關(guān)分子之一［2］，與其受體CXC趨化因子受體4一起作用，有助于MSCs向靶組織遷移歸巢［3］，而提高靶區(qū)SDF-1濃度可促進(jìn)更多的MSCs歸巢。前期研究［4］表明，超聲輻照微泡可提高M(jìn)SCs的移植效率及歸巢能力，其機(jī)制可能為微泡增強(qiáng)的超聲生物學(xué)效應(yīng)可促使MSCs旁分泌SDF-1，使靶區(qū)組織SDF-1含量增高［5］。但關(guān)于超聲輻照微泡促M(fèi)SCs分泌SDF-1的參數(shù)優(yōu)化方面的研究較少。本研究采用擬水平均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)法，選取超聲輻照強(qiáng)度、超聲輻照時(shí)間及微泡濃度3個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，各設(shè)5個(gè)水平以篩選影響MSCs分泌SDF-1的最優(yōu)因素組合。

材料與方法

一、主要材料與儀器

人骨髓MSCs細(xì)胞株（美國(guó)Sciencell公司）；干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技公司）；0.25%EDTA-胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司）；人SDF-1 ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司）；CCK-8溶液（北京碧云天生物技術(shù)公司）；造影劑“脂氟顯”（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科實(shí)驗(yàn)室自制）為脂質(zhì)膜包裹全氟丙烷氣體的微泡，粒徑2～10μm，其中98%小于8μm，微泡平均濃度約為（7～8）×109個(gè)/ml，使用前用生理鹽水稀釋至相應(yīng)濃度；酶聯(lián)免疫分析儀（F039300，澳大利亞Tecan公司）；超聲治療儀（Accusonic Plus，澳大利亞Metro Medical公司），除輻照強(qiáng)度和輻照時(shí)間隨實(shí)驗(yàn)調(diào)整外，超聲發(fā)射頻率固定為1 MHz，占空比設(shè)為10%。

二、主要實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將人骨髓MSCs細(xì)胞株用含10%胎牛血清的干細(xì)胞完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每4～6天傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液后以每孔1×106的密度接種于六孔板中，每孔細(xì)胞懸液量約2 ml，放于孵箱靜置6～8 h，待細(xì)胞完全貼壁后即可用于不同影響因素條件下的超聲輻照。

2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組：采用雙均數(shù)擬水平均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)，選定超聲輻照強(qiáng)度、超聲輻照時(shí)間、微泡濃度3個(gè)常見(jiàn)影響因素，每因素設(shè)5個(gè)水平，分別為：①超聲輻照強(qiáng)度，即0（對(duì)照）、0.2、0.4、0.6、0.8 W/cm2；②超聲輻照時(shí)間，即0（對(duì)照）、20、30、40、60 s；③微泡濃度，即0（對(duì)照）、102、104、106、108個(gè)/ml。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)表U15（155）安排的實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行超聲輻照，應(yīng)用多元線性回歸及逐步回歸統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，并綜合考慮各因素間的關(guān)系，以相對(duì)高的SDF-1分泌量（上清液中SDF-1濃度）和相對(duì)低的細(xì)胞死亡率（MSCs存活率）為目標(biāo)，確定最優(yōu)影響因素組合。然后分別按照超聲輻照時(shí)間、超聲輻照強(qiáng)度、微泡濃度3個(gè)因素進(jìn)行驗(yàn)證，具體：①考察超聲輻照強(qiáng)度，分為0（對(duì)照）、0.2、0.4、0.6、0.8 W/cm2，此時(shí)超聲輻照時(shí)間30 s，微泡濃度106個(gè)/ml；②考察超聲輻照時(shí)間，分為0（對(duì)照）、20、30、40、60 s，此時(shí)超聲輻照強(qiáng)度0.6 W/cm2，微泡濃度106個(gè)/ml；③考察微泡濃度，分為0（對(duì)照）、102、104、106、108個(gè)/ml，此時(shí)超聲輻照時(shí)間30 s，超聲輻照強(qiáng)度0.6 W/cm2。

3.ELISA法檢測(cè)SDF-1含量：將人骨髓MSCs經(jīng)超聲輻照并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分別吸取每孔上清液作為樣品。將不同濃度的SDF-1標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋后的各個(gè)樣品加入酶標(biāo)板內(nèi)，按照人SDF-1 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟依次操作，最后使用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定樣品于450 nm光譜處的吸光度值，根據(jù)樣品的吸光度值和稀釋倍數(shù)檢測(cè)樣品濃度。

4.CCK-8法評(píng)估細(xì)胞活性：將人骨髓MSCs經(jīng)超聲輻照并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組人骨髓MSCs制成單細(xì)胞懸液，以每孔2×103的密度接種于96孔板中，每孔100μl，將未被超聲輻照的人骨髓MSCs設(shè)為對(duì)照。將96孔板于孵箱靜置6～12 h待細(xì)胞全部貼壁后，每孔加入10μl CCK-8溶液。孵箱繼續(xù)放置2 h后，設(shè)僅含有100μl單純細(xì)胞培養(yǎng)基的孔為空白對(duì)照孔，采用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)量每個(gè)樣品孔于450 nm光譜處的吸光度值，細(xì)胞存活率（%）=樣品孔吸光度值/空白對(duì)照孔的吸光度值×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，參數(shù)篩選采用雙指標(biāo)擬水平均勻設(shè)計(jì)，應(yīng)用多元線性回歸分析及逐步回歸分析篩選最優(yōu)影響因素組合。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、優(yōu)化SDF-1分泌的最優(yōu)影響因素組合

通過(guò)雙指標(biāo)擬水平均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的因素，按U15（155）均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 超聲輻照參數(shù)篩選實(shí)驗(yàn)擬水平均勻設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用多元線性回歸分析，得到雙指標(biāo)的回歸方程為：

兩個(gè)回歸方程對(duì)應(yīng)的概率值P=0.003、0.014，均小于0.05，總回歸效果顯著。偏回歸效果檢驗(yàn)顯示，因素B（微泡濃度）對(duì)SDF-1分泌量的偏回歸貢獻(xiàn)不顯著（P＜0.05），說(shuō)明其對(duì)SDF-1分泌量的作用可由其他因素代替，故需進(jìn)一步行逐步回歸分析，得逐步回歸方程為：

方程對(duì)應(yīng)的概率值P＜0.05，總回歸效果顯著。采用方程（2）、（3）對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，并綜合考慮各因素間關(guān)系后，最終確定最優(yōu)影響因素組合為超聲輻照強(qiáng)度0.6 W/cm2，超聲輻照時(shí)間30 s，微泡濃度106個(gè)/ml。

二、不同參數(shù)條件下SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細(xì)胞存活率結(jié)果

1.超聲輻照后即刻，光鏡下可見(jiàn)貼壁的人骨髓MSCs胞質(zhì)回縮，細(xì)胞折光率增強(qiáng)，超聲輻照強(qiáng)度加大時(shí)部分細(xì)胞甚至漂浮起來(lái)。放于孵箱靜置培養(yǎng)24 h后，絕大部分人骨髓MSCs會(huì)重新貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)與正常細(xì)胞相比無(wú)明顯差別。見(jiàn)圖1。隨著超聲輻照強(qiáng)度增加，存活下來(lái)貼壁生長(zhǎng)的人骨髓MSCs越來(lái)越少。

圖1 人骨髓MSCs在微泡濃度106個(gè)/ml、超聲輻照時(shí)間30 s即刻及輻照后24 h不同超聲輻照強(qiáng)度下的光鏡圖（×100）

2.對(duì)優(yōu)化篩選后的影響因素進(jìn)行驗(yàn)證，超聲輻照強(qiáng)度、微泡濃度和超聲輻照時(shí)間3個(gè)因素對(duì)SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖2。圖2A顯示，隨著超聲輻照強(qiáng)度的增強(qiáng)，SDF-1濃度逐漸增大，輻照強(qiáng)度為0.6 W/cm2時(shí)，SDF-1濃度達(dá)到峰值（551.67±40.88）ρg/ml，當(dāng)輻照強(qiáng)度繼續(xù)增大至0.8 W/cm2，SDF-1濃度反而下降；同時(shí)，細(xì)胞存活率隨著超聲輻照強(qiáng)度的增加顯著降低，輻照強(qiáng)度為0.6 W/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率為（88.51±4.03）%，輻照強(qiáng)度繼續(xù)增加至0.8 W/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率下降至（71.02±7.97）%。圖2B顯示，SDF-1濃度隨超聲輻照時(shí)間增加而增加，超聲輻照強(qiáng)度為0.6 W/cm2時(shí)SDF-1濃度達(dá)到峰值，超聲輻照時(shí)間＞30 s時(shí)，SDF-1濃度即開(kāi)始下降，輻照時(shí)間為60 s時(shí)，SDF-1濃度降至（492.47±19.64）ρg/ml；另外，超聲輻照時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞存活率越低，輻照時(shí)間為60 s時(shí)降至（65.67±6.04）%。圖2C顯示，隨著微泡濃度的增大，SDF-1濃度也逐漸增大，于微泡濃度為106個(gè)/ml時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)微泡濃度增大至108個(gè)/ml，SDF-1濃度下降至（468.16±49.91）ρg/ml，同時(shí)細(xì)胞存活率也顯著下降至（62.26±7.27）%。結(jié)果顯示，當(dāng)超聲輻照強(qiáng)度為0.6 W/cm2、超聲輻照時(shí)間為30 s、微泡濃度為106個(gè)/ml時(shí)，SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細(xì)胞存活率可達(dá)到相對(duì)匹配的數(shù)值。

圖2 不同影響因素條件下超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1和細(xì)胞存活情況

討論

在醫(yī)院臨床和基礎(chǔ)研究中經(jīng)常接觸到包含多因素、多水平雙指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)，如交叉匹配各個(gè)因素和水平進(jìn)行全面實(shí)驗(yàn)，不僅要花費(fèi)大量的人力、物力，還需相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，顯然是不實(shí)際的。正交設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法均能在不影響實(shí)驗(yàn)效果的前提下，盡可能減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，前者的實(shí)驗(yàn)次數(shù)是后者實(shí)驗(yàn)次數(shù)的整數(shù)倍，故均勻設(shè)計(jì)法是一種更加高效、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。本研究采用擬水平均勻設(shè)計(jì)超聲輻照微泡后人骨髓MSCs SDF-1分泌量和MSCs細(xì)胞存活率的雙指標(biāo)實(shí)驗(yàn)，旨在探討超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的最優(yōu)條件。

方程（2）中，因素A（超聲輻照強(qiáng)度）、B（微泡濃度）、C（超聲輻照時(shí)間）系數(shù)均為負(fù)值，具有阻礙細(xì)胞存活的作用，說(shuō)明取低值有利于細(xì)胞存活，適宜范圍內(nèi)應(yīng)取下限值；方程（3）中，因素A、C系數(shù)均為正值，具有促進(jìn)SDF-1分泌的作用，說(shuō)明高值有利于SDF-1分泌，適宜范圍內(nèi)應(yīng)取上限值，因素B不包含于方程（3）中，說(shuō)明不同的因素B取值對(duì)SDF-1分泌無(wú)明顯的影響作用，可作為常量。綜合分析，因素A對(duì)促SDF-1分泌與細(xì)胞存活率有相反作用的影響，且對(duì)促SDF-1分泌的影響更大，故取較中間值大一點(diǎn)的數(shù)值，即0.6 W/cm2；因素C對(duì)促SDF-1分泌與細(xì)胞存活率也有相反作用的影響且影響力類似，故取中間值30 s；因素B對(duì)促SDF-1分泌無(wú)影響，對(duì)細(xì)胞存活率有影響，宜取低值，但由于方程（2）中因素B的系數(shù)為-1.791E-7，B的取值范圍為0～106個(gè)/ml，實(shí)際上對(duì)細(xì)胞存活的影響均微小，僅當(dāng)因素B的取值達(dá)到108個(gè)/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率才有顯著的阻礙作用，考慮到實(shí)際操作的準(zhǔn)確性（微泡濃度越低操作誤差越大），因素B取106個(gè)/ml。所以，根據(jù)方程（2）、（3），綜合考慮促SDF-1分泌量和高的細(xì)胞存活率的最優(yōu)影響因素組合為：超聲輻照強(qiáng)度0.6 W/cm2，微泡濃度106個(gè)/ml，超聲輻照時(shí)間30 s。

研究［6-7］表明，超聲輻照微泡雖可促使人骨髓MSCs分泌SDF-1，但隨著超聲輻照強(qiáng)度、輻照時(shí)間的增加，其輻照能量也不斷增強(qiáng)，超過(guò)一定閾值后，細(xì)胞就會(huì)溶解和死亡。超聲微泡造影劑注入體內(nèi)后，作為空化核可以大大降低超聲生物學(xué)效應(yīng)（主要是空化效應(yīng)）的閾值，使空化效應(yīng)強(qiáng)度顯著增加。在離體實(shí)驗(yàn)［8］中，當(dāng)細(xì)胞周圍存在大量空化核（如微泡造影劑）時(shí)，微泡增強(qiáng)的超聲空化效應(yīng)也可對(duì)被輻照細(xì)胞造成不可逆的損傷。所以，需要找到超聲輻照時(shí)間、輻照強(qiáng)度和微泡數(shù)量/濃度的最優(yōu)組合，希望在保證較多的MSCs存活的前提下，超聲輻照微泡能有效促進(jìn)其分泌更多的SDF-1。本研究結(jié)果提示，超聲輻照強(qiáng)度、超聲輻照時(shí)間或微泡濃度超過(guò)一定閾值后，大量的人骨髓MSCs會(huì)因輻照能量過(guò)高或空化核濃度過(guò)大而死亡，導(dǎo)致相應(yīng)的SDF-1分泌量也減少。本研究采用均勻設(shè)計(jì)法和回歸分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選出體外超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的最優(yōu)影響因素組合，即超聲輻照強(qiáng)度0.6 W/cm2，超聲輻照時(shí)間30 s，微泡濃度106個(gè)/ml。使用該最優(yōu)組合時(shí)人骨髓MSCs的存活率為（88.51±4.03）%，同時(shí)SDF-1分泌量顯著增加，達(dá)（551.67±40.88）ρg/ml。當(dāng)然，超聲輻照微泡作用于動(dòng)物或人體時(shí)，涉及的相關(guān)超聲作用因素更多，優(yōu)化篩選過(guò)程也會(huì)更加復(fù)雜，需后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)一步探討。

綜上所述，采用擬水平均勻設(shè)計(jì)法篩選出超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1和細(xì)胞存活率達(dá)到相對(duì)匹配的最優(yōu)影響因素組合為：超聲輻照強(qiáng)度0.6 W/cm2，超聲輻照時(shí)間30 s，微泡濃度106個(gè)/ml。