武 勇，孟憲梅，江振宇，王 晶，張靜潔，周 怡，年嬡嬡

(包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院內蒙古消化病研究所，內蒙古 包頭 014030)

目前在世界范圍內，宮頸癌的發(fā)生嚴重威脅著女性的健康。據了解全球每年新患宮頸癌的人數超過50萬人，已成為繼乳腺癌之后危害廣大婦女健康的第二大殺手。經流行病學統(tǒng)計分析及分子生物學證實，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPVs)感染尤其是高危型HPVs與宮頸癌的發(fā)生存在著密切的病因學關系。而高危型人HPVs 尤其是高危型HPVs 16 E6/E7 兩個癌基因在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。經研究發(fā)現HPVs E6/E7在被HPVs感染的組織中持續(xù)保留并表達，并在使細胞發(fā)生惡性轉化方面起著至關重要的作用，因此成為宮頸癌核酸治療的理想靶點。反義技術包括反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，AS-ODNs)及核酶 (ribozymes， RZs)技術。應用反義核酸技術抑制HPV16 和HPV18 E6/E7 轉錄，阻止目的基因表達從而消除HPVs致癌作用。而目前，具有基因敲除效應的RNA干擾技術的出現，為宮頸癌治療的治療帶來了廣闊的前景。

1 人乳頭瘤病毒與宮頸癌

HPVs感染是最常見的肛門生殖器惡性腫瘤的病因。目前已克隆鑒定的HPVs亞型已超過100多種，根據致病力的大小，可將HPVs分為高危型HPVs(High risk-HPVs，HR-HPVs)和低危型HPVs(low risk-HPVs，LR-HPVs)。通過大量的流行病學和分子生物學統(tǒng)計研究表明，HR-HPVs特別是HPV16 及HPV 18與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的病因學關系。

HPVs為無包膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒，屬乳多空病毒科A亞群內的一組病毒，有高度種屬特異性和特異的嗜上皮性。HPVs基因組不同區(qū)域基因與HPVs的功能存在著密切的關系，包括編碼區(qū)與非編碼區(qū)。編碼區(qū)基因可分為3個功能區(qū)：早期區(qū)(early region)、晚期區(qū)(late region)和長控制區(qū)(long control region，LCR)。早期區(qū)編碼的E1、E2、E4和E5與病毒基因的復制、轉錄調節(jié)等有關，而早期區(qū)的E6和E7是感染細胞發(fā)生轉化和惡性表型維持的先決條件；晚期區(qū)基因編碼主要衣殼蛋白及次要衣殼蛋白，執(zhí)行著組裝成病毒樣顆粒的作用；長控制區(qū)又稱上游調節(jié)區(qū)(URR區(qū))，含有很多與病毒DNA復制和轉錄調節(jié)及表達所必需的調控元件。由此可見病毒基因的表達受病毒及宿主細胞的轉錄因子調控，其中包括 E2 ，LCR 及細胞內反式調節(jié)因子，它們的改變可使轉化蛋白過表達而致瘤[1-2]。

2 核酸治療的分子靶點

宮頸癌發(fā)生與發(fā)展過程中，E6/E7在被HPVs感染的組織中持續(xù)保留并表達，尤其在使被感染的組織發(fā)生惡性轉化方面中起著重要的作用[3-4]。

HPV16 E6降解 p53是使細胞發(fā)生惡性轉化的關鍵。抑癌蛋白p53，主要功能是參與細胞周期負性調控、促進細胞凋亡、DNA復制及損傷后的修復，從而能夠穩(wěn)定基因組和抑制突變細胞的產生，避免腫瘤的發(fā)生[4]。HPV16 E6蛋白可通過 E6-AP 的介導，促使 p53 蛋白進入泛素依賴降解途徑，p53 蛋白降解，使G1/S期G2/M期的調控點失控，此時被感染的細胞可以克服因遺傳物質損傷引發(fā)的細胞周期停止，從而導致DNA完整性受損的細胞得以過度增殖，從而致使基因突變幾率增加和細胞染色體不穩(wěn)定，另外還可使外源DNA整合到宿主染色體中的幾率升高，從而導致腫瘤發(fā)生[4]。

端粒是真核細胞生物染色體末端DNA的一段富含C的重復序列與結合蛋白組成的復合體，端粒的功能是為染色體加“帽”及加“尾”，以防止染色體發(fā)生降解、融合、重組借以維持染色體的穩(wěn)定性，調節(jié)細胞正常生長。端粒酶是自身攜帶模板的逆轉錄酶，由RNA和蛋白質組成。RNA組分中含有一段短的模板序列與端粒DNA的重復序列互補。而其蛋白質組分具有逆轉錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA的合成，將其加到端粒的3′端，以維持端粒長度及功能。許多實驗發(fā)現，腫瘤細胞的端粒酶活性是增高的，除造血干細胞外，正常細胞的端粒酶幾乎沒有活性。端粒酶可以在多個水平進行活性調控，其中包括hTR及hTERT基因的轉錄、mRNA剪接和成熟、轉錄后修飾，各組分的移位和定位等[5]。E6則是第一個被發(fā)現激活端粒酶的癌基因[6]，可直接通過刺激啟動子，誘導和維持高水平的hTERT，阻斷對p53抑制可導致端粒酶活性增高。從而使細胞賦有無限增殖的能力。

值得注意的是，E6還可通過其C-端PDZ基序(因最初發(fā)現于PSD95、DlgA和ZO-1這三個蛋白質而得名)與調控細胞連接形成和細胞粘附等相關的PDZ蛋白[5]相互作用，使細胞間粘附性降低從而失去接觸性抑制，從而使癌細胞獲得侵襲和轉移的能力。Chen[6]等的研究結果顯示：將HPV16的E6和E7基因轉染入小鼠無侵襲轉移能力的細胞后，可賦予細胞明顯的侵襲和轉移能力。

HPV16 E7在啟動階段(細胞失控性增殖和凋亡抑制發(fā)揮重要作用階段)的作用強于E6，E7促使pRb蛋白進入泛素依賴途徑，結合并降解pRb致使隨后發(fā)生的一系列遺傳事件發(fā)生改變，最終導致細胞的失控性增殖。

因此，HR-HPVs，特別是HPV16的兩個病毒癌基因E6和E7持續(xù)表達不僅是引起感染細胞惡性轉化、惡性表型維持及侵襲和轉移的關鍵，而且為治療性核酸(如反義核苷酸、核酶和siRNA等)治療宮頸癌等HPVs相關腫瘤提供了理想靶點[7]。

3 反義寡聚脫氧核苷酸在治療宮頸癌中的應用

3.1反義寡聚脫氧核苷酸(Antisense Oligodexynucleotides，AS-ODNs)基因技術特點 AS-ODNs基因技術是通過特定靶基因mRNA相互補的DNA序列片斷，按照堿基互補原則，人工合成AS-ODNs與靶基因進行互補結合，從而阻斷靶基因的表達和翻譯，阻斷病程進展達到治療的目的。

AS-ODNs的最佳長度為16～20個堿基，既能與靶基因結合又能避免無意義的雜交。AS-ODNs是通過受體介導的細胞自吞飲作用進入細胞。目前已發(fā)現的蛋白受體有79KD，80KD，90KD的蛋白受體具有CD4家族基因特異性使AS-ODNs易于進入細胞。AS-ODNs應用在腫瘤中的作用機制是：(1)AS-ODNs可以有選擇性和mRNA起始密碼子AUG結合，與氨酰tRNA直接競爭結合位點，從而阻止核糖體閱讀；(2)mRNA-DNA雜交鏈的形成，激活內源性核糖核酸酶RnaseH，使mRNA降解；(3)mRNA-DNA雜交直接抑制蛋白質的翻譯；(4)AS-ODNs與mRNA前體hnRNA結合，抑制正常成熟hnRNA拼接；(5)AS-ODNs與雙鏈DNA形成三股螺旋結構，可競爭抑制激活轉錄蛋白與基因啟動子結合，從而干擾基因轉錄。

由于堿基互補原則使AS-ODNs具有高度靶特異性，從而設計容易、多樣且合成簡單，高度針對性的優(yōu)點。

3.2AS-ODNs作用靶點 E6和E7中作為分子靶點不但為宮頸癌的治療帶來了新的手段，同樣也為HPVs感染所致的其它腫瘤帶來新的思路。有研究報道，應用設計覆蓋HPV E6 E7全長的AS-RNA，通過質粒轉染C4-1細胞，從成功而抑制抑制E6 E7表達。質粒介導的AS-RNA能夠上調p53和釋放細胞色素C到細胞質中致使蛋白酶9和3的激活，誘導細胞凋亡[8]。而以腺病毒作為載體將AS-RNA轉入CaSki細胞中，使HPV16 E7蛋白表達減少，細胞周期停滯及RB蛋白表達增高，下調E2F和Bcl2，從而抑制CaSki細胞的增殖[9]。

因AS-ODNs其作用靶點序列定位準確、容易設計和合成，所以被認為是最具有潛力治療腫瘤的藥物，但是在實際應用中發(fā)現其用量大、抑制效率低及毒性大等特點，再加上成本過高又為臨床應用帶來了難題。隨著現在生物技術的不斷發(fā)展，RNA干擾(RNA interference)除了具有AS-ODNs相同的優(yōu)點之外還具有專一性高、用量少、毒性小等特點，這些特點為臨床應用帶了新的廣闊前景。

4 RNA干擾技術在治療宮頸癌中的應用

4.1RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術特點 RNAi是已證實存在于線蟲、植物、果蠅及哺乳動物中的具有基因敲除效應的dsRNA(double-stranded RNA)[10]。通過將與內源性mRNA互補的dsRNA導入細胞后，引起該mRNA特異性的降解，從而導致mRNA編碼的基因不能表達，發(fā)生基因沉默。

RNAi現象最早要追溯到90年代，在1998年確定并命名。在1990年Napoli[11]等在設計將苯基乙烯酮合成酶基因轉入矮牽牛屬植物來提高色素產量時，發(fā)現轉基因植物的花呈白色或雜色而不是原有的紫色這種效應是其內源性同源基因沉默或受抑制的結果，稱之為共抑制(cosuppression)。在1995年，康奈爾大學的SuGuo教授[12]利用反義RNA技術研究秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)里的par-1基因功能時發(fā)現，par-1基因可與目的基因mRNA互補的反義RNA導入線蟲細胞，使目的基因沉默(gene silencing)。之后將與mRNA序列相同的正義RNA導入細胞，出現相同的結果。在1998年Fire和Mello教授[13]首次應用秀麗新小桿線蟲證明上述現象屬于轉錄后水平的基因沉默，因此發(fā)現正義RNA抑制基因表達的現象，與過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷都是由于體外轉錄得到的RNA中污染了微量dsRNA而引起的。Fire教授將雙鏈RNA(double-strand RNA, dsRNA)注入到秀麗新小桿線蟲時卻能夠高效特異性阻斷相應基因的表達，該小組將這一現象稱為RNAi。

4.2RNAi 作用機制 RNAi是一個由dsRNA誘導的呈多步驟、多因素參與的復雜的過程。dsRNA由核酸內切酶Ⅲ(RNase Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA，siRNA與內切酶、外切酶、螺旋酶結合最終形成RNA誘導的沉默復合物(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC特異性地與目的mRNA同源區(qū)結合，通過酶的作用使mRNA降解，致使目的基因沉默。siRNA具有小分子質量、低濃度、低沉默信號即可在細胞間傳遞甚至傳播至整個機體并可遺傳等特點。需要注意的是，與AS-ODNs相同，siRNA具有較高的序列特異性。

4.3RNAi的應用 早先，用siRNA技術抑制HPV16 E6 E7的表達，以HPV 16 E6 E7 mRNA作為分子靶點特異性的沉默，發(fā)現E6沉默后p53蛋白表達增高，并且細胞周期調控基因p21活性增高從而使細胞增殖受到抑制，而E7沉默則直接導致細胞凋亡。在siRNA轉染的HPV陰性的對照組細胞中，發(fā)現p53及p21無變化。由此表明，具有高效性及高度的特異性siRNA的沉默效應用于宮頸癌基因治療是非常有價值的[14]。

此外通過siRNA的特異性沉默效應不但可以使靶基因失表達，同時還可以使失活的抑癌基因重新發(fā)揮生物學效應，促使細胞向正常方向進展[15]。未經修飾的siRNA則非常不穩(wěn)定，在血清和細胞中很快被核酸酶降解，導致對靶基因的表達抑制只能持續(xù)數天或更短的時間[16]。當具有兩個短反向重復序列及莖環(huán)(loop)組成的短發(fā)夾RNA(Short hairpin RNA，shRNA)，經介質入轉到細胞后，通過RNA聚合酶Ⅲ的作用，可以在細胞內穩(wěn)定表達。因此通過脂質體介導的外源性shRNA可以有高度特異性的持續(xù)表達從而沉默目標mRNA,達到基因沉默的目的。

4.4靶向RNA 設計 與AS-ODNs相同，當目的基因選定后，RNAi可根據堿基順序排列設計與靶向mRNA互補的序列，應用所設計的序列進入細胞后按Watson-Crick堿基互補配對原則與靶向序列形成雙鏈結構，然后通過后續(xù)機制影響靶基因的表達。因此，所設計的序列必須是可以與目的mRNA相互補的序列。通常是通過“semi-rational design”原則[17-18]，對目的序列先進行測序鑒定,選取含有AUG起始密碼的區(qū)域開始，逐個尋找“AA”二連序列，標記其3’端堿基序列作為潛在的siRNA靶位點。因非編碼區(qū)(untranslated regions,UTRs)含有豐富的調控蛋白結合區(qū)域，因此需要避開5’和3’端的UTRs[19]，通過將所選序列和相應的基因組數據庫進行比較，排除那些和其他編碼序列同源的序列后選出合適的靶序列進行合成。

基于以上原則利用計算機分析可以減少對合適序列挑選的計算。然而由于體內微環(huán)境及蛋白、離子的作用，而使得所選定的序列不一定能正常地在體內發(fā)揮作用，因此對于靶序列的選擇及序列的合成是一個較為復雜的過程。

4.5現狀與展望 隨著基因治療手段的不斷成熟，越來越多的基因靶點隨被發(fā)現， 加上藥物作用靶點的開發(fā)，基因功能的研究以極快的速度向前發(fā)展，各種研究基因功能的技術不斷涌現，所以RNAi逐步成為一種強有力的工具，具有巨大的應用前景。RNAi的高效性、用量少、毒副作用小及序列特異性使它成在研究基因功能及基因治療手段上占有極大的優(yōu)勢[20-22]。但又是由于高度的序列特異性使得RNAi在臨床應用方面有些待解決的問題：(1)對靶點序列要求嚴格，1個堿基的錯配都將大大降低目的基因表達的抑制作用；(2)通過載體和脂質體導入細胞內，因細胞來源的不同效果亦有所不同；(3)目前雖然已有研究利用RNAi技術在哺乳動物體內成功地抑制了某些特定基因的表達，但其方法尚不適合于人類。隨著現在科技與醫(yī)學發(fā)展的不斷進步，RNAi研究的不斷深入，所有困難均會迎刃而解，其應用范圍也將會越來越廣。在不久的將來，RNAi作為一種強有力的基因治療手段應用于臨床，在攻克人類疾病方面將會發(fā)揮其巨大的作用[23]。