楊鎮(zhèn)州，李妍，楊雪，劉剛，梁文

上海市計量測試技術研究院化學與電離輻射所生物計量實驗室，上海201203

PCR作為分子生物學的核心技術，已逐漸發(fā)展為最普遍的核酸定性及定量的研究手段，廣泛用于研究生物體基因表達水平、生長發(fā)育、疾病控制等領域[1?6]。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription,RT-PCR）是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈式擴增相結(jié)合的技術[7?9]。由于兩個反應之間無需額外的開蓋和緩沖液更換操作，實現(xiàn)了核糖核酸的一步法檢測，具有可降低污染風險、提高檢測速度、節(jié)省耗材、適用于高通量測定等優(yōu)點，進一步推動了PCR技術基礎的革新。

2019年，新型冠狀病毒肺炎（coronavius disease 2019，COVID-19)疫情爆發(fā)后，我國衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的“新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案”[10]、美國疾病控制與預防中心發(fā)布的“實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測2019新型冠狀病毒”使用說明[11]、歐盟疾病控制與預防中心發(fā)布的“新型冠狀病毒檢測方法和目標”12]等，均以RTPCR檢測陽性作為確診的“金標準”。截至2020年11月3日，獲國家藥監(jiān)局應急審批通過的新冠病毒核酸檢測試劑盒主要為RT-qPCR檢測試劑盒。但是在實際應用中，對于確診患者的核酸檢測，仍然出現(xiàn)了假陰性的問題，該結(jié)果一定程度上與核酸檢測試劑盒的質(zhì)量有關。在生產(chǎn)和保存環(huán)節(jié)中，酶易受保存溫度、抑制劑等影響，因此，酶的質(zhì)量是影響試劑盒性能的主要原因。

在RT-PCR反應過程中，涉及兩種作用的酶，即逆轉(zhuǎn)錄作用的逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合形成雙鏈DNA的DNA聚合酶，如圖1所示。本研究針對新冠病毒檢測試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶兩種酶的作用進行研究，以新型冠狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA標準物質(zhì)為模板，采用相同的引物探針,考察不同新冠核酸檢測試劑盒或原料酶的逆轉(zhuǎn)錄酶性能和PCR反應中的DNA聚合酶性能、熱穩(wěn)定性能等，最終形成客觀有效的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒中酶的質(zhì)量評價方法，旨在為核酸試劑盒的檢測準確性提供質(zhì)量控制支撐。

圖1 RT-PCR反應原理及考察方法Fig.1 RT-PCR reaction principle and investigation methods

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

新型冠狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA標準物質(zhì)[GBW（E）091111，GBW（E）091112，上海市計量測試技術研究院]；A:新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒(AgPath-IDTM一步法RT-PCR預混液，Thermo Fisher)；B:One Step PrimeScriptTMIII RT-qPCR Mix(Takara)；C:一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒(生工生物工程（上海）股份有限公司)；D:TOROIVD Probe 1-step RT-qPCR 5G Premix(Toroivd)；E:新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）雙重核酸檢測試劑盒（熒光PCR法，武漢生之源生物科技股份有限公司)；F:新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法，之江生物）；DNA聚合酶（TOROIVD 5G qPCR Premix）；實時熒光PCR儀（QuantStudio12KFlex，ThermoFisher）。引物探針序列由上海百力格生物技術有限公司合成。

1.2 引物探針序列

針對SARS-CoV-2的核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因，選用我國疾病控制與預防中心推薦使用的引物及熒光探針序列（表1）。

表1 N基因的引物探針序列Table 1 The sequences of primers and probe of the N gene

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑盒中酶的逆轉(zhuǎn)錄性能考察以相同的新型冠狀病毒RNA標準物質(zhì)為檢測靶標，進行逆轉(zhuǎn)錄實驗，其中逆轉(zhuǎn)錄過程采用不同的逆轉(zhuǎn)錄酶，不同的逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生不同濃度的cDNA。使用相同的DNA聚合酶（TOROIVD 5G qPCR Premix）進行實時熒光PCR擴增，每組實驗進行3次重復，計算Ct值。將擴增后的Ct值代入以一個數(shù)字PCR準確定量的cDNA梯度稀釋建立的qPCR工作曲線，得到不同逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的濃度，分析cDNA產(chǎn)物與目標RNA濃度的比值，從而比較逆轉(zhuǎn)錄效率。

1.3.2 試劑盒中酶的PCR性能考察使用1.3.1

中最優(yōu)的逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄得到相同cDNA，進行10倍系列梯度稀釋后（以降低緩沖液對下一步PCR酶的影響），使用6種不同新冠病毒檢測試劑盒中的DNA聚合酶進行實時熒光PCR擴增，每組實驗進行3次重復，計算Ct值并繪制相應的標準曲線，并比較PCR擴增效率。

1.3.3 試劑盒的RT-PCR性能考察使用6種不同試劑盒中的酶和緩沖液，以10倍梯度稀釋的RNA標準物質(zhì)為模板，進行RT-PCR實驗，每組實驗進行3次重復，計算Ct值并繪制標準曲線，對試劑盒的RT-PCR性能進行比較。

1.3.4 試劑盒中酶的熱穩(wěn)定考察分別將6種不同核酸檢測試劑盒中的酶放置于37℃條件下1、3、5、7 d后，將低濃度的RNA標準物質(zhì)（11 copies·μL?1）進行逆轉(zhuǎn)錄?實時熒光PCR擴增，比較實驗結(jié)果，考察不同酶的熱穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄酶的性能評價

本實驗以相同的RNA標準物質(zhì)為檢測靶標，進行逆轉(zhuǎn)錄實驗，其中逆轉(zhuǎn)錄過程采用不同的逆轉(zhuǎn)錄酶，不同的逆轉(zhuǎn)錄酶將會產(chǎn)生不同濃度的cDNA，采用實時熒光定量PCR對cDNA濃度進行定量分析，在PCR擴增效率相同的情況下，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）含量越高，說明逆轉(zhuǎn)錄效率越高，比較逆轉(zhuǎn)錄效率。

實驗過程中，首先建立實時熒光定量PCR的標準曲線（標準樣品是經(jīng)微滴式數(shù)字PCR定量的DNA）：y=?3.39 lg（x）+32.75。代入6個不同逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的Ct值，計算出6種酶產(chǎn)生的cDNA的濃度，與靶標RNA標準物質(zhì)濃度（11 copies·μL?1）相比，得到不同酶的相對逆轉(zhuǎn)錄效率。如圖2所示，6種酶的相對逆轉(zhuǎn)錄效率為6.5%~80.7%。通過逆轉(zhuǎn)錄性能考察實驗，發(fā)現(xiàn)所有試劑盒中的酶均能對RNA標準物質(zhì)的N基因進行有效的逆轉(zhuǎn)錄，但F試劑盒逆轉(zhuǎn)錄效率計算值最低；F試劑檢測相同RNA濃度水平下的Ct值均高于其他試劑盒，在逆轉(zhuǎn)錄效率極低的情況下，會導致Ct值升至太高從而有未檢出的結(jié)果。

圖2 不同酶的逆轉(zhuǎn)錄評價Fig.2 Evaluation of reverse transcription of different enzymes

2.2 試劑盒中酶的PCR擴增性能評價

本實驗使用相同的cDNA樣品，進行10倍梯度稀釋，再使用6種新冠核酸檢測試劑盒中的DNA聚合酶以梯度稀釋的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增效率計算的經(jīng)典公式如下。

其中k為標準曲線方程的斜率[14]。

如圖3所示，以相同濃度的cDNA為模板進行擴增檢測，6種酶的線性系數(shù)均超過0.99，擴增效率為90.4%~119.7%，其中試劑盒D擴增效率最接近100%，且對低濃度cDNA擴增的Ct值也較小，PCR擴增效率相對最優(yōu)。而試劑盒E擴增后的Ct值大，擴增能力較差。試劑盒E計算的擴增效率高達119.7%，分析原因為酶的活性低或酶的活性易受到抑制劑的影響，當樣品濃度過高，PCR擴增時DNA模板不能翻倍復制，導致Ct值增加；當濃度逐漸降低時，酶的活性可使DNA模板翻倍復制，或者抑制劑的濃度降低對酶的活性影響變小，因此，低濃度10倍稀釋模板的Ct值差值較小，計算出的擴增效率較高，但其在整個濃度范圍的DNA聚合酶功能較差。

圖3 不同DNA聚合酶的PCR性能評價Fig.3 PCR performance evaluation of different DNA polymerases

2.3 試劑盒2種酶的整體RT-PCR性能評價

新冠病毒核酸檢測試劑盒是將逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶2種功能整合于一個檢測體系中，本研究中，使用RNA標準物質(zhì)為檢測目標，整體評價檢測試劑盒的RT-PCR性能。使用6種RT-PCR試劑盒中的2種酶，用相同的引物探針，進行RT-PCR擴增，建立標準曲線方程，根據(jù)擴增效率和低濃度擴增效果，從整體評判這6種試劑盒中酶的性能。6種試劑盒的整體逆轉(zhuǎn)錄PCR效率均符合線性的標準曲線R2>0.980，擴增效率為90%~105%。說明所選RT-PCR試劑盒均可以針對新冠N基因進行RT-PCR擴增，但整體的逆轉(zhuǎn)錄擴增效率和R2仍有一定差異。如圖4所示，本實驗所用的6種酶均能對RNA標準物質(zhì)進行有效擴增。其中試劑盒E和試劑盒F的擴增效率較低，與實驗2.1、2.2中結(jié)果一致：F試劑盒的逆轉(zhuǎn)錄效率相對最低，E試劑盒的PCR擴增能力最低。

圖4 不同試劑盒的RT-PCR評價Fig.4 RT-PCR evaluation of different enzymes

2.4 酶的熱穩(wěn)定性研究

除了逆轉(zhuǎn)錄效率及PCR效率外，酶本身的保存溫度、熱穩(wěn)定性等性能也會影響試劑盒的檢測結(jié)果。本研究選用的酶儲存溫度均為?20℃，有效期均大于6個月。然而考慮到試劑盒運輸過程中的實際溫度可能大于20℃，本實驗采用熱穩(wěn)定加速實驗，將試劑置于37℃恒溫條件進行考察。如圖5所示，不同酶的37℃熱穩(wěn)定性不同。低濃度的RNA標準物質(zhì)進行RT-PCR后測得的Ct值隨著天數(shù)的增加而增大，表明在37℃恒溫條件下，6種酶的活性均下降，其中C、D試劑盒在37℃恒溫條件下放置3 d后，樣品無法正常擴增。A、B、F試劑盒在37℃恒溫條件下放置7 d后，陽性樣品能擴增，但擴增Ct值增大。結(jié)果表明，試劑盒中的酶經(jīng)過長時間的高溫運輸或者由于操作不當暴露于較高溫度環(huán)境時，有可能造成最后實驗結(jié)果的假陰性等不良后果，因此，需對酶的熱穩(wěn)定性進行控制，并保證試劑盒低溫運輸。

圖5 不同酶的熱穩(wěn)定性評價Fig.5 Thermal stability evaluations of different RT-PCR enzymes.

3 討論

《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術審評要點》中明確指出，制備廠家需提供主要原材料的選擇、來源、制備過程、質(zhì)量標準等相關研究資料，主要原料包括引物、探針、酶、dNTP等。其中最主要的是對酶活性、功能性等進行評價和驗證。也有文獻[15]研究表明，核酸檢測試劑盒的質(zhì)量問題是導致檢測結(jié)果假陰性的重要原因之一。因此，本實驗采用中國疾病預防控制中心推薦的N基因的引物及熒光探針序列，以新型冠狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA標準物質(zhì)為模板，解決了質(zhì)控這一關鍵問題[15]，從6種核酸檢測試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄效率、PCR反應中的DNA聚合酶性能、整體RT-PCR性能、熱穩(wěn)定性等方面進行探討，旨在建立核酸檢測試劑盒中關鍵酶的質(zhì)量控制評價方法，確保試劑盒核心原料的質(zhì)量，為生產(chǎn)合格的病毒核酸檢測試劑盒提供技術保障。

結(jié)合3個實驗，可得出以下結(jié)論：RT-PCR試劑盒的RT-PCR整體效率，可通過逆轉(zhuǎn)錄效率和PCR效率2個方面進行判斷，三者有顯著相關性。如A、C試劑盒的整體擴增效率，相關系數(shù)良好，而其逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增的效率和相關系數(shù)也較理想。而E、F試劑盒的整體擴增效率，相關系數(shù)相對較差。分別評價其逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶活性，發(fā)現(xiàn)F試劑盒逆轉(zhuǎn)錄效率較低，導致其Ct值比其他試劑盒高2~3個循環(huán)，且PCR酶活性也較低。而試劑E的問題主要在DNA聚合酶上，可重點通過優(yōu)化聚合酶的活性提高整個反應體系的擴增性能。

除逆轉(zhuǎn)錄效率及PCR效率外，酶熱穩(wěn)定性也是其重要特性之一。本實驗數(shù)據(jù)顯示，隨著加熱時間的延長，低濃度（11 copie·μL?1）RNA標物的測得Ct值升高甚至檢測不出，說明溫度對RT-PCR的性能影響較大。RT-PCR整體性能相對較好的A、B試劑盒和相對不理想的F試劑盒，在熱穩(wěn)定性方面均較佳，這說明RT-PCR整體性能與熱穩(wěn)定性無明顯相關性，但熱穩(wěn)定性差的酶經(jīng)過長時間的高溫運輸，或者由于操作不當暴露于較高溫度環(huán)境時，可能造成最后實驗結(jié)果的假陰性等不良后果。

本研究從酶的逆轉(zhuǎn)錄效率、PCR擴增效率、熱穩(wěn)定性的性能進行實驗和探討，最終得到RT-PCR試劑盒中酶的質(zhì)量評價方法，結(jié)果顯示，該方法有助于提高基于RT-PCR原理的核酸檢測試劑盒質(zhì)量，降低經(jīng)濟成本和檢測時間，有效地保證人民群眾的身體健康和生命安全。